Diferenciala diagnozo de pulmaj noduloj identigitaj per komputita tomografio (KT) restas defio en klinika praktiko. Ĉi tie, ni karakterizas la tutmondan metabolomon de 480 serumaj specimenoj, inkluzive de sanaj kontroloj, benignaj pulmaj noduloj kaj pulma adenokancero en stadio I. Adenokanceroj montras unikajn metabolomikajn profilojn, dum benignaj noduloj kaj sanaj individuoj havas altan similecon en metabolomikaj profiloj. En la malkovra grupo (n = 306), aro de 27 metabolitoj estis identigita por diferencigi inter benignaj kaj malignaj noduloj. La AUC de la diskriminanta modelo en la interna validigaj (n = 104) kaj ekstera validigaj (n = 111) grupoj estis 0,915 kaj 0,945, respektive. Analizo de la vojoj rivelis pliigitajn glikolizajn metabolitojn asociitajn kun malpliiĝinta triptofano en pulma adenokancera serumo kompare kun benignaj noduloj kaj sanaj kontroloj, kaj sugestis, ke triptofana sorbado antaŭenigas glikolizon en pulmaj kanceraj ĉeloj. Nia studo elstarigas la valoron de serumaj metabolitaj biosignoj en taksado de la risko de pulmaj noduloj detektitaj per komputila tomografio.
Frua diagnozo estas kritika por plibonigi postvivadoprocentojn por kanceruloj. Rezultoj de la usona Nacia Testo pri Pulma Kancero-Rastrumo (NLST) kaj la Eŭropa NELSON-Studo montris, ke rastrumo per malaltdoza komputita tomografio (LDCT) povas signife redukti la mortecon pro pulma kancero en altriskaj grupoj1,2,3. Ekde la ĝeneraligita uzo de LDCT por rastrumo de pulma kancero, la incidenco de hazardaj radiografiaj trovoj de asimptomaj pulmaj noduloj daŭre pliiĝis4. Pulmaj noduloj estas difinitaj kiel fokusaj opakecoj ĝis 3 cm en diametro5. Ni alfrontas malfacilaĵojn en taksado de la probableco de maligneco kaj traktado de la granda nombro da pulmaj noduloj detektitaj hazarde per LDCT. Limigoj de CT povas konduki al oftaj sekvaj ekzamenoj kaj falspozitivaj rezultoj, kondukante al nenecesa interveno kaj trotraktado6. Tial, necesas disvolvi fidindajn kaj utilajn biosignojn por ĝuste identigi pulman kanceron en la fruaj stadioj kaj diferencigi plej multajn benignajn nodulojn ĉe la komenca detekto7.
Ampleksa molekula analizo de sango (serumo, plasmo, mononukleaj ĉeloj el periferia sango), inkluzive de genomiko, proteomiko aŭ DNA-metiligo8,9,10, kondukis al kreskanta intereso pri la malkovro de diagnozaj biosignoj por pulma kancero. Dume, metabolomikaj aliroj mezuras ĉelajn finproduktojn, kiuj estas influitaj de endogenaj kaj eksogenaj agoj kaj tial estas aplikataj por antaŭdiri la komencon kaj rezulton de la malsano. Likva kromatografio-tandema masspektrometrio (LC-MS) estas vaste uzata metodo por metabolomikaj studoj pro sia alta sentemo kaj granda dinamika gamo, kiu povas kovri metabolitojn kun malsamaj fizik-kemiaj ecoj11,12,13. Kvankam tutmonda metabolomika analizo de plasmo/serumo estis uzata por identigi biosignojn asociitajn kun diagnozo de pulma kancero14,15,16,17 kaj efikeco de kuracado,18 serumaj metabolito-klasifikiloj por distingi inter benignaj kaj malignaj pulmaj nodoj restas multe studataj. -amasa esplorado.
Adenokancero kaj skvama ĉelkancero estas la du ĉefaj subtipoj de ne-malgrandĉela pulma kancero (NSCLC). Diversaj komputilaj komputilaj rastrumtestoj indikas, ke adenokancero estas la plej ofta histologia tipo de pulma kancero1,19,20,21. En ĉi tiu studo, ni uzis ultra-efikecan likvan kromatografion-alt-rezolucian mas-spektrometrion (UPLC-HRMS) por plenumi metabolomikan analizon sur entute 695 serumaj specimenoj, inkluzive de sanaj kontroloj, benignaj pulmaj noduloj, kaj komputile detektitaj ≤3 cm. Rastrumo por pulma adenokancero en Stadio I. Ni identigis panelon de serumaj metabolitoj, kiuj distingas pulman adenokanceromon de benignaj noduloj kaj sanaj kontroloj. Analizo de riĉigo de la vojoj rivelis, ke nenormala triptofano- kaj glukozo-metabolo estas oftaj ŝanĝoj en pulma adenokancero kompare kun benignaj noduloj kaj sanaj kontroloj. Fine, ni establis kaj validigis seruman metabolan klasifikilon kun alta specifeco kaj sentemo por distingi inter malignaj kaj benignaj pulmaj noduloj detektitaj per LDCT, kio povus helpi en frua diferenciga diagnozo kaj riskotakso.
En la nuna studo, seks- kaj aĝ-kongruaj serumaj specimenoj estis retrospektive kolektitaj de 174 sanaj kontroloj, 292 pacientoj kun benignaj pulmaj nodoj, kaj 229 pacientoj kun pulma adenokancero en stadio I. Demografiaj karakterizaĵoj de la 695 subjektoj estas montritaj en Aldona Tabelo 1.
Kiel montrite en Figuro 1a, entute 480 serumaj specimenoj, inkluzive de 174 sanaj kontroloj (HC), 170 benignaj nodoj (BN), kaj 136 specimenoj de pulma adenokancero (LA) en stadio I, estis kolektitaj ĉe la Kancera Centro de la Universitato Sun Yat-sen. Malkovra kohorto por necelita metabolomika profilado uzante ultra-efikecan likvan kromatografion-alt-rezolucian masspektrometrion (UPLC-HRMS). Kiel montrite en Aldona Figuro 1, diferencigaj metabolitoj inter LA kaj HC, LA kaj BN estis identigitaj por establi klasifikan modelon kaj plue esplori diferencigan vojanalizon. 104 specimenoj kolektitaj de la Kancera Centro de la Universitato Sun Yat-sen kaj 111 specimenoj kolektitaj de du aliaj hospitaloj estis submetitaj al interna kaj ekstera validigo, respektive.
a Studa populacio en la malkovra kohorto, kiu spertis tutmondan seruman metabolomikan analizon uzante ultra-efikecan likvan kromatografion-alt-rezolucian mas-spektrometrion (UPLC-HRMS). b Parta plej malgrandaj kvadrataj diskriminanta analizo (PLS-DA) de la tuta metabolomo de 480 serumaj specimenoj de la studa kohorto, inkluzive de sanaj kontroloj (HC, n = 174), benignaj nodoj (BN, n = 170), kaj stadio I pulma adenokancero (Los-Anĝeleso, n = 136). +ESI, pozitiva elektrospraja joniga reĝimo, -ESI, negativa elektrospraja joniga reĝimo. c–e Metabolitoj kun signife malsamaj abundecoj en du donitaj grupoj (duvosta Wilcoxon-signotesto, malvera malkovra indico adaptita p-valoro, FDR <0.05) estas montritaj ruĝe (falda ŝanĝo > 1.2) kaj blue (falda ŝanĝo < 0.83). ) montritaj sur la vulkana grafikaĵo. f Hierarkia agregacia varmomapo montranta signifajn diferencojn en la nombro de prinotitaj metabolitoj inter LA kaj BN. Fontaj datumoj estas provizitaj en la formo de fontaj datumdosieroj.
La totala seruma metabolomo de 174 HC, 170 BN kaj 136 LA en la malkovra grupo estis analizita per UPLC-HRMS-analizo. Ni unue montras, ke kvalitkontrolaj (QC) specimenoj grupiĝas dense en la centro de memstara ĉefkomponanta analizo (PCA) modelo, konfirmante la stabilecon de la agado de la nuna studo (Aldona Figuro 2).
Kiel montrite en la parta plej malgrandaj kvadrataj diskriminanta analizo (PLS-DA) en Figuro 1b, ni trovis, ke ekzistis klaraj diferencoj inter LA kaj BN, LA kaj HC en pozitivaj (+ESI) kaj negativaj (−ESI) elektrosprajaj jonigaj reĝimoj. izolitaj. Tamen, neniuj signifaj diferencoj estis trovitaj inter BN kaj HC en +ESI kaj -ESI kondiĉoj.
Ni trovis 382 diferencigajn trajtojn inter LA kaj HC, 231 diferencigajn trajtojn inter LA kaj BN, kaj 95 diferencigajn trajtojn inter BN kaj HC (testo de Wilcoxon kun signo de rango, FDR <0.05 kaj multobla ŝanĝo >1.2 aŭ <0.83) (Figuro .1c-e). . Pintoj estis plue prinotitaj (Aldonaj Datumoj 3) kontraŭ datumbazo (biblioteko mzCloud/HMDB/Chemspider) per m/z-valoro, retentempo kaj fragmentiĝa amasspektra serĉo (detaloj priskribitaj en la sekcio Metodoj) 22. Fine, 33 kaj 38 prinotitaj metabolitoj kun signifaj diferencoj en abundeco estis identigitaj por LA kontraŭ BN (Figuro 1f kaj Aldona Tabelo 2) kaj LA kontraŭ HC (Aldona Figuro 3 kaj Aldona Tabelo 2), respektive. Kontraste, nur 3 metabolitoj kun signifaj diferencoj en abundeco estis identigitaj en BN kaj HC (Aldona Tabelo 2), konforme al la interkovro inter BN kaj HC en PLS-DA. Ĉi tiuj diferencigaj metabolitoj kovras vastan gamon da biokemiaĵoj (Aldona Figuro 4). Sume, ĉi tiuj rezultoj montras signifajn ŝanĝojn en la seruma metabolo, kiuj reflektas malignan transformiĝon de fru-stadia pulma kancero kompare kun benignaj pulmaj nodoj aŭ sanaj individuoj. Dume, la simileco de la seruma metabolo de BN kaj HC sugestas, ke benignaj pulmaj nodoj povas dividi multajn biologiajn karakterizaĵojn kun sanaj individuoj. Ĉar mutacioj en la genoj de la epiderma kreskofaktoro-receptoro (EGFR) estas oftaj en pulma adenokancera subtipo 23, ni celis determini la efikon de pelaj mutacioj sur la seruman metabolomon. Ni tiam analizis la ĝeneralan metaboloman profilon de 72 kazoj kun EGFR-statuso en la pulma adenokancera grupo. Interese, ni trovis kompareblajn profilojn inter EGFR-mutaciaj pacientoj (n = 41) kaj EGFR-sovaĝ-tipaj pacientoj (n = 31) en PCA-analizo (Aldona Figuro 5a). Tamen, ni identigis 7 metabolitojn, kies abundeco estis signife ŝanĝita en pacientoj kun EGFR-mutacio kompare kun pacientoj kun sovaĝ-tipa EGFR (t-testo, p < 0,05 kaj ŝanĝo > 1,2 aŭ < 0,83) (Aldona Figuro 5b). La plimulto de ĉi tiuj metabolitoj (5 el 7) estas acilkarnitinoj, kiuj ludas gravan rolon en la oksidigaj vojoj de grasacidoj.
Kiel ilustrite en la laborfluo montrita en Figuro 2a, biosignoj por nodulklasifiko estis akiritaj uzante malplej absolutan ŝrumpadoperatorojn kaj selektadon bazitan sur 33 diferencigaj metabolitoj identigitaj en LA (n = 136) kaj BN (n = 170). Plej bona kombinaĵo de variabloj (LASSO) - binara loĝistika regresmodelo. Dekobla krucvalidigo estis uzita por testi la fidindecon de la modelo. Variabla selektado kaj parametra reguligo estas alĝustigitaj per verŝajneca maksimumiga puno kun parametro λ24. Tutmonda metabolomika analizo estis plue efektivigita sendepende en la interna validigaj (n = 104) kaj ekstera validigaj (n = 111) grupoj por testi la klasifikan efikecon de la diskriminanta modelo. Rezulte, 27 metabolitoj en la malkovra aro estis identigitaj kiel la plej bona diskriminanta modelo kun la plej granda meza AUC-valoro (Fig. 2b), inter kiuj 9 havis pliigitan aktivecon kaj 18 malpliigitan aktivecon en LA kompare kun BN (Fig. 2c).
Laborfluo por konstrui klasigilon de pulmaj nodoj, inkluzive de elektado de la plej bona panelo de serumaj metabolitoj en la malkovra aro uzante binaran loĝistikan regresmodelon per dekobla kruc-validigo kaj taksado de prognoza agado en internaj kaj eksteraj validigaj aroj. b Kruc-validigaj statistikoj de LASSO-regresmodelo por metabola biosigno-elekto. La nombroj donitaj supre reprezentas la mezan nombron de biosignoj elektitaj ĉe difinita λ. La ruĝa punktita linio reprezentas la mezan AUC-valoron ĉe la koresponda lambdo. Grizaj erarstangoj reprezentas la minimumajn kaj maksimumajn AUC-valorojn. La punktita linio indikas la plej bonan modelon kun la 27 elektitaj biosignoj. AUC, areo sub la ricevila funkciiga karakteriza kurbo (ROC). c Faldŝanĝoj de 27 elektitaj metabolitoj en la LA-grupo kompare kun la BN-grupo en la malkovra grupo. Ruĝa kolumno - aktivigo. La blua kolumno estas malkresko. d–f Ricevilaj funkciigaj karakterizaj kurboj (ROC) montrantaj la potencon de la diskriminanta modelo bazita sur 27 metabolitaj kombinaĵoj en la malkovraj, internaj kaj eksteraj validigaj aroj. Fontaj datumoj estas provizitaj en la formo de fontaj datumdosieroj.
Prognoza modelo estis kreita bazita sur la pezbalancitaj regresaj koeficientoj de ĉi tiuj 27 metabolitoj (Aldona Tabelo 3). ROC-analizo bazita sur ĉi tiuj 27 metabolitoj rezultigis areon sub la kurbo (AUC) de 0.933, la sentemo de la malkovra grupo estis 0.868, kaj specifeco estis 0.859 (Fig. 2d). Dume, inter la 38 prinotitaj diferencigaj metabolitoj inter LA kaj HC, aro de 16 metabolitoj atingis AUC de 0.902 kun sentemo de 0.801 kaj specifeco de 0.856 en distingado de LA de HC (Aldona Figuro 6a-c). AUC-valoroj bazitaj sur malsamaj ŝanĝsojloj por diferencigaj metabolitoj ankaŭ estis komparitaj. Ni trovis, ke la klasifika modelo funkciis plej bone en distingado inter LA kaj BN (HC) kiam la ŝanĝnivelo estis agordita al 1.2 kontraŭ 1.5 aŭ 2.0 (Aldona Figuro 7a,b). La klasifika modelo, bazita sur 27 metabolitgrupoj, estis plue validigita en internaj kaj eksteraj kohortoj. La AUC estis 0.915 (sentemo 0.867, specifeco 0.811) por interna validigo kaj 0.945 (sentemo 0.810, specifeco 0.979) por ekstera validigo (Fig. 2e, f). Por taksi interlaboratorian efikecon, 40 specimenoj el la ekstera kohorto estis analizitaj en ekstera laboratorio kiel priskribite en la sekcio Metodoj. La klasifika precizeco atingis AUC de 0.925 (Aldona Figuro 8). Ĉar pulma skvama ĉelkancero (LUSC) estas la dua plej ofta subtipo de ne-malgrandĉela pulma kancero (NSCLC) post pulma adenokancero (LUAD), ni ankaŭ testis la validigitan eblan utilecon de metabolaj profiloj. BN kaj 16 kazoj de LUSC. La AUC de diskriminacio inter LUSC kaj BN estis 0.776 (Aldona Figuro 9), indikante pli malbonan kapablon kompare kun diskriminacio inter LUAD kaj BN.
Studoj montris, ke la grandeco de noduloj sur komputilaj tomografioj (KT) estas pozitive korelaciita kun la probableco de maligneco kaj restas grava determinanto de nodultraktado25,26,27. Analizo de datumoj de la granda kohorto de la NELSON-rastruma studo montris, ke la risko de maligneco ĉe subjektoj kun nodoj <5 mm estis eĉ simila al tiu ĉe subjektoj sen nodoj 28. Tial, la minimuma grandeco postulanta regulan KT-monitoradon estas 5 mm, kiel rekomendita de la Brita Toraka Societo (BTS), kaj 6 mm, kiel rekomendita de la Fleischner-Societo 29. Tamen, noduloj pli grandaj ol 6 mm kaj sen evidentaj benignaj trajtoj, nomataj nedifinitaj pulmaj nodoj (IPN), restas grava defio en taksado kaj administrado en klinika praktiko30,31. Ni poste ekzamenis ĉu la grandeco de nodoj influis metabolomajn signaturojn uzante kunigitajn specimenojn de la malkovraj kaj internaj validigaj kohortoj. Fokusiĝante sur 27 validigitaj biosignoj, ni unue komparis la PCA-profilojn de HC kaj BN sub-6 mm metabolomoj. Ni trovis, ke la plej multaj el la datenpunktoj por HC kaj BN interkovriĝis, montrante, ke la serumaj metabolitniveloj estis similaj en ambaŭ grupoj (Fig. 3a). La trajtomapadoj trans malsamaj grandecintervaloj restis konservitaj en BN kaj LA (Fig. 3b, c), dum apartigo estis observita inter malignaj kaj benignaj noduloj en la intervalo 6-20 mm (Fig. 3d). Ĉi tiu kohorto havis AUC de 0.927, specifecon de 0.868, kaj sentemon de 0.820 por antaŭdiri la malignecon de noduloj mezurantaj 6 ĝis 20 mm (Fig. 3e, f). Niaj rezultoj montras, ke la klasifikilo povas kapti metabolajn ŝanĝojn kaŭzitajn de frua maligna transformo, sendepende de la grandeco de la nodulo.
ad Komparo de PCA-profiloj inter specifaj grupoj bazita sur metabola klasifikilo de 27 metabolitoj. CC kaj BN < 6 mm. b BN < 6 mm kontraŭ BN 6–20 mm. en LA 6–20 mm kontraŭ LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm kaj LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Kurbo de ricevanta funkcianta karakterizaĵo (ROC) montranta la efikecon de la diskriminanta modelo por noduloj 6–20 mm. f Probablovaloroj estis kalkulitaj surbaze de la loĝistika regresmodelo por noduloj mezurantaj 6–20 mm. La griza punktita linio reprezentas la optimuman limvaloron (0,455). La nombroj supre reprezentas la procenton de kazoj projekciitaj por Los-Anĝeleso. Uzu duflankan Student-t-teston. PCA, ĉefkomponanta analizo. AUC-areo sub la kurbo. Fontaj datumoj estas provizitaj en la formo de fontaj datendosieroj.
Kvar specimenoj (en aĝo de 44–61 jaroj) kun similaj grandecoj de pulmaj noduloj (7–9 mm) estis plue elektitaj por ilustri la efikecon de la proponita modelo por prognozi malignecon (Fig. 4a, b). Ĉe komenca ekzameno, Kazo 1 prezentiĝis kiel solida nodo kun kalkiĝo, trajto asociita kun benigneco, dum Kazo 2 prezentiĝis kiel nedifinita parte solida nodo sen evidentaj benignaj trajtoj. Tri rondoj de sekvaj CT-skanadoj montris, ke ĉi tiuj kazoj restis stabilaj dum 4-jara periodo kaj tial estis konsiderataj benignaj noduloj (Fig. 4a). Kompare kun klinika taksado de seriaj CT-skanadoj, unu-pafa analizo de serumaj metabolitoj per la nuna klasifikilo rapide kaj ĝuste identigis ĉi tiujn benignajn nodulojn surbaze de probablaj limigoj (Tabelo 1). Figuro 4b en kazo 3 montras nodon kun signoj de pleŭra retiriĝo, kiu plej ofte asociiĝas kun maligneco32. Kazo 4 prezentiĝis kiel nedifinita parte solida nodo sen evidenteco de benigna kaŭzo. Ĉiuj ĉi tiuj kazoj estis antaŭdiritaj kiel malignaj laŭ la klasifikilo-modelo (Tabelo 1). La takso de pulma adenokancero estis montrita per histopatologia ekzameno post pulma resekca kirurgio (Fig. 4b). Por la ekstera validiga aro, la metabola klasifikilo precize antaŭdiris du kazojn de nedifinitaj pulmaj nodoj pli grandaj ol 6 mm (Aldona Figuro 10).
Komputilaj tomografioj (KT) de la aksa fenestro de la pulmoj de du kazoj de benignaj noduloj. En kazo 1, KT post 4 jaroj montris stabilan solidan nodon mezurantan 7 mm kun kalkiĝo en la dekstra malsupra lobo. En kazo 2, KT post 5 jaroj montris stabilan, parte solidan nodon kun diametro de 7 mm en la dekstra supra lobo. b Aksaj KT-bildoj de la pulmoj kaj respondaj patologiaj studoj de du kazoj de adenokancero en stadio I antaŭ pulma resekco. Kazo 3 montris nodon kun diametro de 8 mm en la dekstra supra lobo kun pleŭra retiriĝo. Kazo 4 montris parte solidan ŝlifvitran nodon mezurantan 9 mm en la maldekstra supra lobo. Hematoksilino kaj eozino (H&E) kolorigo de resekciota pulma histo (skalbreto = 50 μm) montrante la acinan kreskopadronon de pulma adenokancero. Sagoj indikas nodulojn detektitajn sur KT-bildoj. H&E-bildoj estas reprezentaj bildoj de multoblaj (>3) mikroskopaj kampoj ekzamenitaj de la patologiisto.
Entute, niaj rezultoj montras la eblan valoron de serumaj metabolitaj biosignoj en la diferenciga diagnozo de pulmaj noduloj, kio povas prezenti defiojn dum taksado de komputila tomografio.
Surbaze de validigita diferenciga metabolita panelo, ni celis identigi biologiajn korelaciojn de gravaj metabolaj ŝanĝoj. Analizo per KEGG-riĉigo de la vojoj fare de MetaboAnalyst identigis 6 komunajn signife ŝanĝitajn vojojn inter la du donitaj grupoj (LA kontraŭ HC kaj LA kontraŭ BN, adaptita p ≤ 0.001, efiko > 0.01). Ĉi tiuj ŝanĝoj estis karakterizitaj per perturboj en piruvata metabolo, triptofana metabolo, niacina kaj nikotinamida metabolo, glikolizo, la TCA-ciklo, kaj purina metabolo (Fig. 5a). Ni poste plue plenumis celitan metabolomikon por kontroli gravajn ŝanĝojn uzante absolutan kvantigon. Determinado de komunaj metabolitoj en ofte ŝanĝitaj vojoj per triobla kvadrupola masspektrometrio (QQQ) uzante aŭtentajn metabolitajn normojn. Demografiaj karakterizaĵoj de la cela specimeno de la metabolomika studo estas inkluzivitaj en Aldona Tabelo 4. Kongrue kun niaj tutmondaj metabolomikaj rezultoj, kvanta analizo konfirmis, ke hipoksantino kaj ksantino, piruvato kaj laktato estis pliigitaj en LA kompare kun BN kaj HC (Fig. 5b, c, p <0.05). Tamen, neniuj signifaj diferencoj en ĉi tiuj metabolitoj estis trovitaj inter BN kaj HC.
Analizo per KEGG-riĉigo de signife malsamaj metabolitoj en la LA-grupo kompare kun la BN- kaj HC-grupoj. Du-vosta Tutmondtesto estis uzita, kaj p-valoroj estis ĝustigitaj per la metodo de Holm-Bonferroni (ĝustigita p ≤ 0.001 kaj efikograndeco > 0.01). b–d Violonaj grafikaĵoj montrantaj nivelojn de hipoksantino, ksantino, laktato, piruvato kaj triptofano en serumaj HC, BN kaj LA determinitaj per LC-MS/MS (n = 70 por grupo). Blankaj kaj nigraj punktitaj linioj indikas la medianon kaj kvartilon, respektive. e Violona grafikaĵo montranta normaligitan Log2TPM (transskribaĵoj por miliono) mRNA-esprimon de SLC7A5 kaj QPRT en pulma adenokancero (n = 513) kompare kun normala pulma histo (n = 59) en la datumbazo LUAD-TCGA. La blanka skatolo reprezentas la interkvartilan intervalon, la horizontala nigra linio en la centro reprezentas la medianon, kaj la vertikala nigra linio etendiĝanta de la skatolo reprezentas la 95%-an konfidintervalon (KI). f Pearson-korelacia grafikaĵo de SLC7A5 kaj GAPDH-esprimo en pulma adenokancero (n = 513) kaj normala pulma histo (n = 59) en la TCGA-datumbazo. La griza areo reprezentas la 95%-an KONFI. r, Pearson-korelacia koeficiento. g Normaligitaj ĉelaj triptofanaj niveloj en A549-ĉeloj transfektitaj per nespecifa shRNA-kontrolo (NC) kaj shSLC7A5 (Sh1, Sh2) determinitaj per LC-MS/MS. Statistika analizo de kvin biologie sendependaj specimenoj en ĉiu grupo estas prezentita. h Ĉelaj niveloj de NADt (totala NAD, inkluzive de NAD+ kaj NADH) en A549-ĉeloj (NC) kaj SLC7A5-malsuprenreguligitaj A549-ĉeloj (Sh1, Sh2). Statistika analizo de tri biologie sendependaj specimenoj en ĉiu grupo estas prezentita. i Glikoliza aktiveco de A549-ĉeloj antaŭ kaj post la malaktivigo de SLC7A5 estis mezurita per la eksterĉela acidiĝa indico (ECAR) (n = 4 biologie sendependaj specimenoj por grupo). 2-DG,2-deoksi-D-glukozo. Du-vosta Studenta t-testo estis uzata en (b-h). En (g-i), erarstangoj reprezentas la meznombron ± norma devio, ĉiu eksperimento estis farita tri fojojn sendepende kaj la rezultoj estis similaj. Fontaj datumoj estas provizitaj en la formo de fontaj datendosieroj.
Konsiderante la signifan efikon de ŝanĝita triptofana metabolo en la LA-grupo, ni ankaŭ taksis serumajn triptofanajn nivelojn en la HC, BN, kaj LA-grupoj uzante QQQ. Ni trovis, ke seruma triptofano estis reduktita en LA kompare kun HC aŭ BN (p < 0.001, Figuro 5d), kio kongruas kun antaŭaj trovoj, ke cirkulantaj triptofanaj niveloj estas pli malaltaj ĉe pacientoj kun pulma kancero ol ĉe sanaj kontroloj el la kontrolgrupo33,34,35. Alia studo uzanta PET/CT-spurilon 11C-metil-L-triptofano trovis, ke la retentempo de triptofana signalo en pulmakancera histo estis signife pliigita kompare kun benignaj lezoj aŭ normala histo36. Ni hipotezas, ke la malpliiĝo de triptofano en LA-serumo povas reflekti aktivan triptofanan asimiladon fare de pulmakanceraj ĉeloj.
Estas ankaŭ konate, ke la fina produkto de la kinurenina vojo de triptofana katabolo estas NAD+37,38, kiu estas grava substrato por la reakcio de gliceraldehido-3-fosfato kun 1,3-bisfosfoglicerato en glikolizo39. Dum antaŭaj studoj fokusiĝis al la rolo de triptofana katabolo en imunreguligo, ni celis klarigi la interrilaton inter triptofana disreguligo kaj glikolizaj vojoj observitaj en la nuna studo. Soluta transportilo-familio 7 membro 5 (SLC7A5) estas konata kiel triptofana transportilo43,44,45. Kinolina acida fosforibosiltransferazo (QPRT) estas enzimo situanta laŭflue de la kinurenina vojo, kiu konvertas kinolinan acidon al NAMN46. Inspektado de la LUAD TCGA-datumbazo rivelis, ke kaj SLC7A5 kaj QPRT estis signife plireguligitaj en tumora histo kompare kun normala histo (Fig. 5e). Ĉi tiu pliiĝo estis observita en stadioj I kaj II same kiel stadioj III kaj IV de pulma adenokancero (Aldona Figuro 11), indikante fruajn perturbojn en triptofana metabolo asociitaj kun tumorigenezo.
Plie, la datumbazo LUAD-TCGA montris pozitivan korelacion inter la esprimo de SLC7A5 kaj GAPDH mRNA en specimenoj de kanceruloj (r = 0.45, p = 1.55E-26, Figuro 5f). Kontraste, neniu signifa korelacio estis trovita inter tiaj genaj signaturoj en normala pulma histo (r = 0.25, p = 0.06, Figuro 5f). Malaltigo de SLC7A5 (Aldona Figuro 12) en A549-ĉeloj signife reduktis ĉelajn triptofano- kaj NAD(H)-nivelojn (Figuro 5g,h), rezultante en malpliigita glikoliza agado kiel mezurita per eksterĉela acidiĝa indico (ECAR) (Figuro 1). 5i). Tiel, surbaze de metabolaj ŝanĝoj en serumo kaj en vitro detekto, ni hipotezas, ke triptofana metabolo povas produkti NAD+ per la kinurenina vojo kaj ludi gravan rolon en antaŭenigado de glikolizo en pulma kancero.
Studoj montris, ke granda nombro da nedifinitaj pulmaj noduloj detektitaj per LDCT povas konduki al la bezono de pliaj testoj kiel PET-CT, pulma biopsio kaj troa traktado pro falspozitiva diagnozo de maligneco.31 Kiel montrite en Figuro 6, nia studo identigis panelon de serumaj metabolitoj kun ebla diagnoza valoro, kiu povas plibonigi riskotavoligon kaj postan traktadon de pulmaj noduloj detektitaj per CT.
Pulmaj noduloj estas taksataj per malaltdoza komputita tomografio (LDCT) kun bildigaj trajtoj sugestantaj benignajn aŭ malignajn kaŭzojn. La necerta rezulto de noduloj povas konduki al oftaj sekvaj vizitoj, nenecesaj intervenoj kaj troa traktado. La inkludo de serumaj metabolaj klasifikiloj kun diagnoza valoro povas plibonigi riskotakson kaj postan traktadon de pulmaj noduloj. PET pozitrona emisia tomografio.
Datumoj el la usona studo NLST kaj la eŭropa studo NELSON sugestas, ke ekzamenado de altriskaj grupoj per malaltdoza komputita tomografio (LDCT) povus redukti la mortecon pro pulma kancero1,3. Tamen, riskotakso kaj posta klinika traktado de granda nombro da hazardaj pulmaj nodoj detektitaj per LDCT restas la plej malfacilaj. La ĉefa celo estas optimumigi la ĝustan klasifikon de ekzistantaj LDCT-bazitaj protokoloj per integrigo de fidindaj biosignoj.
Certaj molekulaj biosignoj, kiel ekzemple sangaj metabolitoj, estis identigitaj per komparo de pulma kancero kun sanaj kontroloj15,17. En la nuna studo, ni fokusiĝis al la apliko de seruma metabolomika analizo por distingi inter benignaj kaj malignaj pulmaj noduloj hazarde detektitaj per LDCT. Ni komparis la tutmondan seruman metabolomon de sana kontrolo (HC), benignaj pulmaj noduloj (BN), kaj stadio I pulmaj adenokancero- (LA) specimenoj uzante UPLC-HRMS-analizon. Ni trovis, ke HC kaj BN havis similajn metabolajn profilojn, dum LA montris signifajn ŝanĝojn kompare kun HC kaj BN. Ni identigis du arojn de serumaj metabolitoj, kiuj diferencigas LA de HC kaj BN.
La nuna LDCT-bazita identigskemo por benignaj kaj malignaj noduloj baziĝas ĉefe sur la grandeco, denseco, morfologio kaj kreskorapideco de noduloj laŭlonge de la tempo30. Antaŭaj studoj montris, ke la grandeco de noduloj estas proksime rilata al la probableco de pulma kancero. Eĉ ĉe altriskaj pacientoj, la risko de maligneco en noduloj <6 mm estas <1%. La risko de maligneco por noduloj mezurantaj 6 ĝis 20 mm varias de 8% ĝis 64%30. Tial, la Fleischner-Societo rekomendas limdiametron de 6 mm por rutina CT-sekvado.29 Tamen, riskotakso kaj traktado de nedifinitaj pulmaj noduloj (IPN) pli grandaj ol 6 mm ne estis adekvate faritaj31. Nuna traktado de denaska kormalsano kutime baziĝas sur atentema atendado kun ofta CT-monitorado.
Surbaze de la validigita metabolomo, ni unuafoje montris la interkovron de metabolomaj signaturoj inter sanaj individuoj kaj benignaj noduloj <6 mm. La biologia simileco kongruas kun antaŭaj rezultoj de komputila tomografio, ke la risko de maligneco por noduloj <6 mm estas tiel malalta kiel por subjektoj sen nodoj.30 Notindas, ke niaj rezultoj ankaŭ montras, ke benignaj noduloj <6 mm kaj ≥6 mm havas altan similecon en metabolomaj profiloj, sugestante, ke la funkcia difino de benigna etiologio estas kohera sendepende de la grandeco de la nodoj. Tiel, modernaj diagnozaj paneloj de serumaj metabolitoj povas provizi unuopan analizon kiel ekskluzivan teston kiam noduloj estas komence detektitaj per komputila tomografio kaj eble redukti serian monitoradon. Samtempe, la sama panelo de metabolaj biosignoj distingis malignajn nodulojn ≥6 mm grandajn de benignaj noduloj kaj provizis precizajn prognozojn por IPN-oj de simila grandeco kaj ambiguaj morfologiaj trajtoj en komputilaj tomografioj. Ĉi tiu seruma metabolklasifikilo bone funkciis en antaŭdirado de la maligneco de noduloj ≥6 mm kun AUC de 0.927. Entute, niaj rezultoj indikas, ke unikaj serumaj metabolomaj signaturoj povas specife reflekti fruajn tumor-induktitajn metabolajn ŝanĝojn kaj havi eblan valoron kiel riskoprognozantoj, sendepende de la grandeco de noduloj.
Rimarkinde, pulma adenokancero (LUAD) kaj skvama ĉelkancero (LUSC) estas la ĉefaj tipoj de ne-malgrandĉela pulma kancero (NSCLC). Ĉar LUSC estas forte asociita kun tabakkonsumo47 kaj LUAD estas la plej ofta histologio de hazardaj pulmaj nodoj detektitaj per komputila tomografio48, nia klasifikilo estis specife konstruita por adenokanceraj specimenoj en stadio I. Wang kaj kolegoj ankaŭ fokusiĝis al LUAD kaj identigis naŭ lipidajn signaturojn uzante lipidomikon por distingi fru-stadian pulman kanceron de sanaj individuoj17. Ni testis la nunan klasifikilon sur 16 kazoj de stadio I LUSC kaj 74 benignaj nodoj kaj observis malaltan precizecon de prognozo de LUSC (AUC 0.776), sugestante, ke LUAD kaj LUSC eble havas siajn proprajn metabolomajn signaturojn. Efektive, LUAD kaj LUSC montriĝis diferenci laŭ etiologio, biologia origino kaj genetikaj aberacioj49. Tial, aliaj specoj de histologio devus esti inkluditaj en trejnadmodeloj por populaci-bazita detekto de pulma kancero en rastrumprogramoj.
Ĉi tie, ni identigis la ses plej ofte ŝanĝitajn vojojn en pulma adenokancero kompare kun sanaj kontroloj kaj benignaj nodoj. Ksantino kaj hipoksantino estas oftaj metabolitoj de la purina metabola vojo. Kongrue kun niaj rezultoj, intermediatoj asociitaj kun purina metabolo estis signife pliigitaj en la serumo aŭ histoj de pacientoj kun pulma adenokancero kompare kun sanaj kontroloj aŭ pacientoj en la antaŭinvazia stadio15,50. Levitaj serumaj ksantinaj kaj hipoksantinaj niveloj povas reflekti la anabolon bezonatan de rapide proliferantaj kanceraj ĉeloj. Disregulado de glukoza metabolo estas konata karakterizaĵo de kancera metabolo51. Ĉi tie, ni observis signifan pliiĝon de piruvato kaj laktato en la LA-grupo kompare kun la HC kaj BN-grupo, kio kongruas kun antaŭaj raportoj pri glikolizaj vojo-anomalioj en la serumaj metabolomaj profiloj de ne-malgrandĉelaj pulmaj kanceraj (NSCLC) pacientoj kaj sanaj kontroloj. La rezultoj estas kongruaj52,53.
Grave, ni observis inversan korelacion inter la metabolo de piruvato kaj triptofano en la serumo de pulmaj adenokanceroj. Serumaj triptofanaj niveloj estis reduktitaj en la LA-grupo kompare kun la HC- aŭ BN-grupo. Interese, antaŭa grandskala studo uzanta prospektivan kohorton trovis, ke malaltaj niveloj de cirkulanta triptofano estis asociitaj kun pliigita risko de pulma kancero 54. Triptofano estas esenca aminoacido, kiun ni ricevas tute el nutraĵoj. Ni konkludas, ke seruma triptofana malplenigo en pulma adenokancero povas reflekti rapidan malplenigon de ĉi tiu metabolito. Estas bone konate, ke la fina produkto de triptofana katabolo per la kinurenina vojo estas la fonto de de novo NAD+-sintezo. Ĉar NAD+ estas produktita ĉefe per la savvojo, la graveco de NAD+ en triptofana metabolo en sano kaj malsano restas determinita 46. Nia analizo de la TCGA-datumbazo montris, ke la esprimo de la triptofana transportilo-soluta transportilo 7A5 (SLC7A5) estis signife pliigita en pulma adenokancero kompare kun normalaj kontroloj kaj estis pozitive korelaciita kun la esprimo de la glikoliza enzimo GAPDH. Antaŭaj studoj ĉefe fokusiĝis al la rolo de triptofana katabolo en subpremado de la kontraŭtumora imuna respondo40,41,42. Ĉi tie ni montras, ke inhibicio de triptofana sorbado per malaktivigo de SLC7A5 en pulmaj kanceraj ĉeloj rezultas en posta malpliiĝo de ĉelaj NAD-niveloj kaj akompananta malpliiĝo de glikoliza agado. Resumante, nia studo provizas biologian bazon por ŝanĝoj en seruma metabolo asociitaj kun maligna transformo de pulma adenokancero.
EGFR-mutacioj estas la plej oftaj pelaj mutacioj ĉe pacientoj kun NSCLC. En nia studo, ni trovis, ke pacientoj kun EGFR-mutacio (n = 41) havis ĝeneralajn metabolomikajn profilojn similajn al pacientoj kun sovaĝ-tipa EGFR (n = 31), kvankam ni trovis malpliiĝintajn serumajn nivelojn de iuj EGFR-mutaciaj pacientoj ĉe acilkarnitinaj pacientoj. La establita funkcio de acilkarnitinoj estas transporti acilgrupojn de la citoplasmo en la mitokondrian matricon, kondukante al la oksidado de grasacidoj por produkti energion 55. Konforme al niaj trovoj, lastatempa studo ankaŭ identigis similajn metabolomajn profilojn inter EGFR-mutaciaj kaj EGFR-sovaĝ-tipaj tumoroj analizante la tutmondan metabolomon de 102 pulmaj adenokanceraj histaj specimenoj 50. Interese, acilkarnitina enhavo ankaŭ estis trovita en la EGFR-mutacia grupo. Tial, ĉu ŝanĝoj en acilkarnitinaj niveloj reflektas EGFR-induktitajn metabolajn ŝanĝojn kaj la subestajn molekulajn vojojn povus esti necesa por plia studo.
Konklude, nia studo establas seruman metabolan klasifikilon por la diferenciga diagnozo de pulmaj noduloj kaj proponas laborfluon, kiu povas optimumigi riskotakson kaj faciligi klinikan administradon bazitan sur CT-skanado.
Ĉi tiu studo estis aprobita de la Etikkomitato de la Kancera Hospitalo de la Universitato Sun Yat-sen, la Unua Filiigita Hospitalo de la Universitato Sun Yat-sen, kaj la Etikkomitato de la Kancera Hospitalo de la Universitato Zhengzhou. En la grupoj de malkovro kaj interna validigo, 174 serumoj de sanaj individuoj kaj 244 serumoj de benignaj noduloj estis kolektitaj de individuoj submetitaj al ĉiujaraj medicinaj ekzamenoj ĉe la Departemento de Kancera Kontrolo kaj Preventado, Kancera Centro de la Universitato Sun Yat-sen, kaj 166 benignaj noduloj serumo. Pulmaj adenokanceromoj de stadio I estis kolektitaj de la Kancera Centro de la Universitato Sun Yat-sen. En la ekstera validiga kohorto, estis 48 kazoj de benignaj noduloj, 39 kazoj de pulma adenokancero de stadio I de la Unua Filiigita Hospitalo de la Universitato Sun Yat-sen, kaj 24 kazoj de pulma adenokancero de stadio I de la Kancera Hospitalo de Zhengzhou. La Kancera Centro de la Universitato Sun Jat-sen ankaŭ kolektis 16 kazojn de skvamaĉela pulma kancero en stadio I por testi la diagnozan kapablon de la establita metabola klasifikilo (pacientaj karakterizaĵoj estas montritaj en Aldona Tabelo 5). Specimenoj el la malkovra kohorto kaj la interna validiga kohorto estis kolektitaj inter januaro 2018 kaj majo 2020. Specimenoj por la ekstera validiga kohorto estis kolektitaj inter aŭgusto 2021 kaj oktobro 2022. Por minimumigi seksan antaŭjuĝon, proksimume egalaj nombroj da viraj kaj virinaj kazoj estis asignitaj al ĉiu kohorto. Malkovra Teamo kaj Interna Revizia Teamo. La sekso de la partoprenantoj estis determinita surbaze de memraporto. Informita konsento estis akirita de ĉiuj partoprenantoj kaj neniu kompenso estis provizita. Subjektoj kun benignaj noduloj estis tiuj kun stabila CT-skanada poentaro je 2 ĝis 5 jaroj dum la analizo, krom 1 kazo el la ekstera validiga specimeno, kiu estis kolektita antaŭoperacie kaj diagnozita per histopatologio. Kun la escepto de kronika bronkito. Kazoj de pulma adenokancero estis kolektitaj antaŭ pulma resekco kaj konfirmitaj per patologia diagnozo. Fastumaj sangospecimenoj estis kolektitaj en serumaj apartigaj tuboj sen iuj antikoagulantoj. Sangospecimenoj estis koaguligitaj dum 1 horo je ĉambra temperaturo kaj poste centrifugitaj je 2851 × g dum 10 minutoj je 4°C por kolekti seruman supernatanton. Serumaj alikvotoj estis frostigitaj je -80°C ĝis ekstraktado de metabolitoj. La Departemento pri Kancero-Preventado kaj Medicina Ekzameno de la Kancera Centro de la Universitato Sun Jat-sen kolektis serumon de 100 sanaj donacantoj, inkluzive de egala nombro da viroj kaj virinoj en aĝo de 40 ĝis 55 jaroj. Egalaj volumoj de ĉiu donaca specimeno estis miksitaj, la rezulta aro estis alikvotita kaj konservita je -80°C. La seruma miksaĵo estis uzata kiel referenca materialo por kvalito-kontrolo kaj datennormigo.
Referenca serumo kaj testaj specimenoj estis degelitaj kaj metabolitoj estis ekstraktitaj uzante kombinitan ekstraktan metodon (MTBE/metanolo/akvo) 56. Mallonge, 50 μl da serumo estis miksitaj kun 225 μl da glacie malvarma metanolo kaj 750 μl da glacie malvarma metil-tert-butil-etero (MTBE). Kirlu la miksaĵon kaj kovu sur glacio dum 1 horo. La specimenoj estis poste miksitaj kaj kirlite miksitaj kun 188 μl da MS-grada akvo enhavanta internajn normojn (13C-laktato, 13C3-piruvato, 13C-metionino, kaj 13C6-izoleŭcino, aĉetitaj de Cambridge Isotope Laboratories). La miksaĵo estis poste centrifugita je 15 000 × g dum 10 minutoj je 4 °C, kaj la pli malalta fazo estis transdonita en du tubojn (po 125 μL) por LC-MS-analizo en pozitiva kaj negativa reĝimoj. Fine, la specimeno estis vaporigita ĝis sekeco en alt-rapida vakua koncentrilo.
La sekigitaj metabolitoj estis rekonstruitaj en 120 μl da 80% acetonitrilo, kirlite dum 5 minutoj, kaj centrifugitaj je 15 000 × g dum 10 minutoj je 4 °C. Supernatantoj estis translokigitaj en sukcenkolorajn vitrajn fiolojn kun mikroenigaĵoj por metabolomikaj studoj. Necelita metabolomika analizo sur platformo por ultra-efikeca likva kromatografio-alt-rezolucia masspektrometrio (UPLC-HRMS). Metabolitoj estis apartigitaj uzante sistemon Dionex Ultimate 3000 UPLC kaj kolumnon ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). En pozitiva jona reĝimo, la moveblaj fazoj estis 95% (A) kaj 50% acetonitrilo (B), ĉiu enhavanta 10 mmol/L da amonia acetato kaj 0,1% da formika acido. En negativa reĝimo, la moveblaj fazoj A kaj B enhavis respektive 95% kaj 50% acetonitrilon, ambaŭ fazoj enhavis 10 mmol/L da amonia acetato, pH = 9. La gradienta programo estis jena: 0–0,5 min, 2% B; 0,5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16,1 min, 98–2% B; 16,1–20 min, 2% B. La kolono estis konservata je 40°C kaj la specimeno je 10°C en la aŭtomata specimenilo. La flukvanto estis 0,3 ml/min, la injektovolumeno estis 3 μl. Masspektrometro Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) kun elektrospraja joniga (ESI) fonto estis funkciigita en plena skanada reĝimo kaj kunligita kun la monitorada reĝimo ddMS2 por kolekti grandajn kvantojn da datumoj. La MS-parametroj estis agorditaj jene: ŝpruca tensio +3.8 kV/- 3.2 kV, kapilara temperaturo 320 °C, ŝirma gaso 40 arb, helpa gaso 10 arb, temperaturo de la sonda hejtilo 350 °C, skanada intervalo 70–1050 m/h, rezolucio 0.70 000. Datumoj estis akiritaj per Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Por taksi la datenkvaliton, kunigitaj kvalitkontrolaj (QC) specimenoj estis generitaj per forigo de 10 μL da alikvotoj de la supernatant el ĉiu specimeno. Ses injektoj de kvalitkontrolaj specimenoj estis analizitaj komence de la analiza sekvenco por taksi la stabilecon de la UPLC-MS-sistemo. Kvalitkontrolaj specimenoj estas poste periode enkondukitaj en la aron. Ĉiuj 11 aroj de serumaj specimenoj en ĉi tiu studo estis analizitaj per LC-MS. Alikvotoj de seruma kuniga miksaĵo de 100 sanaj donantoj estis uzitaj kiel referenca materialo en respektivaj aroj por monitori la ekstraktadprocezon kaj alĝustigi laŭ aro-al-aro efikoj. Necelita metabolomika analizo de la malkovra kohorto, interna validiga kohorto kaj ekstera validiga kohorto estis farita ĉe la Metabolomika Centro de la Universitato Sun Jat-sen. La ekstera laboratorio de la Analiza kaj Testa Centro de la Teknologia Universitato de Gŭangdongo ankaŭ analizis 40 specimenojn de la ekstera kohorto por testi la rendimenton de la klasifikila modelo.
Post ekstraktado kaj rekonstruo, absoluta kvantigo de serumaj metabolitoj estis mezurita uzante ultra-alt-efikecan likvan kromatografion-tandeman mas-spektrometrion (Agilent 6495 triobla kvadrupolo) kun elektrospraja joniga (ESI) fonto en plurreakcia monitorada (MRM) reĝimo. ACQUITY BEH Amida kolono (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) estis uzata por apartigi metabolitojn. La movebla fazo konsistis el 90% (A) kaj 5% acetonitrilo (B) kun 10 mmol/L amonia acetato kaj 0.1% amoniaka solvaĵo. La gradienta programo estis jena: 0–1.5 min, 0% B; 1.5–6.5 min, 0–15% B; 6.5–8 min, 15% B; 8–8.5 min, 15%–0% B; 8.5–11.5 min, 0%B. La kolono estis konservita je 40 °C kaj la specimeno je 10 °C en la aŭtomata specimenilo. La flukvanto estis 0.3 mL/min kaj la injekta volumeno estis 1 μL. MS-parametroj estis agorditaj jene: kapilara tensio ±3.5 kV, nebulizila premo 35 psi, ingogasa fluo 12 L/min, ingogasa temperaturo 350 °C, sekigagasa temperaturo 250 °C, kaj sekigagasa fluo 14 l/min. La MRM-konvertoj de triptofano, piruvato, laktato, hipoksantino kaj ksantino estis 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 kaj 151.0–107.9 respektive. Datumoj estis kolektitaj uzante Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Por serumaj specimenoj, triptofano, piruvato, laktato, hipoksantino kaj ksantino estis kvantigitaj uzante kalibrajn kurbojn de normaj miksaĵsolvoj. Por ĉelspecimenoj, la enhavo de triptofano estis normaligita al la interna normo kaj ĉelproteina maso.
Pintekstraktado (m/z kaj retentempo (RT)) estis efektivigita uzante Compound Discovery 3.1 kaj TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Por elimini eblajn diferencojn inter aroj, ĉiu karakteriza pinto de la testspecimeno estis dividita per la karakteriza pinto de la referenca materialo el la sama aro por akiri la relativan abundon. La relativaj normaj devioj de internaj normoj antaŭ kaj post normigo estas montritaj en Aldona Tabelo 6. Diferencoj inter la du grupoj estis karakterizitaj per malĝusta malkovro-ofteco (FDR<0.05, Wilcoxon-signo-rangtesto) kaj faldoŝanĝo (>1.2 aŭ <0.83). Krudaj MS-datumoj de la ekstraktitaj trajtoj kaj referencaj serum-korektitaj MS-datumoj estas montritaj en Aldonaj Datumoj 1 kaj Aldonaj Datumoj 2, respektive. Pintekstraktado estis efektivigita surbaze de kvar difinitaj niveloj de identigo, inkluzive de identigitaj metabolitoj, supozeble prinotitaj kombinaĵoj, supozeble karakterizitaj kombinaĵoklasoj, kaj nekonataj kombinaĵoj 22. Surbaze de datumbazaj serĉoj en Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), biologiaj kombinaĵoj kun MS/MS-kongruaj validigitaj normoj aŭ precizaj kongruaj prinotoj en mzCloud (poentaro > 85) aŭ Chemspider estis fine elektitaj kiel intermediatoj inter la diferenciga metabolomo. Pintaj prinotoj por ĉiu trajto estas inkluzivitaj en Suplementaj Datumoj 3. MetaboAnalyst 5.0 estis uzata por unuvariabla analizo de sum-normaligita metabolita abundo. MetaboAnalyst 5.0 ankaŭ taksis KEGG-vojan riĉiganalizon bazitan sur signife malsamaj metabolitoj. Ĉefkomponanta analizo (PCA) kaj parta plej malgrandaj kvadrataj diskriminanta analizo (PLS-DA) estis analizitaj uzante la programaron rotls (v.1.26.4) kun staka normaligo kaj aŭtomata skalado. La optimuma metabolita biosigna modelo por antaŭdiri nodulan malignecon estis generita uzante binaran loĝistikan regreson kun plej malgranda absoluta ŝrumpado kaj selektada operatoro (LASSO, R-pakaĵo v.4.1-3). La agado de la diskriminanta modelo en la detekto- kaj validigo-aroj estis karakterizita per taksado de AUC bazita sur ROC-analizo laŭ la pROC-pakaĵo (v.1.18.0.). La optimuma probablec-limigo estis akirita surbaze de la maksimuma Youden-indekso de la modelo (sentemo + specifeco – 1). Specimenoj kun valoroj malpli aŭ pli grandaj ol la sojlo estos antaŭdiritaj kiel benignaj noduloj kaj pulma adenokancero, respektive.
A549-ĉeloj (#CCL-185, American Type Culture Collection) estis kreskigitaj en F-12K-medio enhavanta 10% FBS. Mallongaj harpinglaj RNA-sekvencoj (shRNA) celantaj SLC7A5 kaj necela kontrolo (NC) estis enigitaj en la lentivirusan vektoron pLKO.1-puro. La kontraŭsencaj sekvencoj de shSLC7A5 estas jenaj: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Antikorpoj kontraŭ SLC7A5 (#5347) kaj tubulino (#2148) estis aĉetitaj de Cell Signaling Technology. Antikorpoj kontraŭ SLC7A5 kaj tubulino estis uzitaj je diluo de 1:1000 por okcidenta makulanalizo.
La Seahorse XF Glikoliza Stresotesto mezuras eksterĉelajn acidiĝajn (ECAR) nivelojn. En la analizo, glukozo, oligomicino A, kaj 2-DG estis administritaj sinsekve por testi ĉelan glikolizan kapaciton kiel mezurita per ECAR.
A549-ĉeloj transfektitaj per ne-cela kontrolo (NC) kaj shSLC7A5 (Sh1, Sh2) estis plantitaj dumnokte en 10 cm diametraj pladoj. Ĉelaj metabolitoj estis ekstraktitaj per 1 ml da glacie malvarma 80% akva metanolo. Ĉeloj en la metanola solvaĵo estis skrapitaj, kolektitaj en novan tubon, kaj centrifugitaj je 15,000 × g dum 15 minutoj je 4 °C. Kolektu 800 µl da supernatanto kaj sekigu uzante alt-rapidan vakuan koncentrilon. La sekigitaj metabolitaj buletoj estis poste analizitaj pri triptofanaj niveloj uzante LC-MS/MS kiel priskribite supre. Ĉelaj NAD(H)-niveloj en A549-ĉeloj (NC kaj shSLC7A5) estis mezuritaj uzante kvantan NAD+/NADH-kolorimetrian ilaron (#K337, BioVision) laŭ la instrukcioj de la fabrikanto. Proteinaj niveloj estis mezuritaj por ĉiu specimeno por normaligi la kvanton de metabolitoj.
Neniuj statistikaj metodoj estis uzitaj por antaŭe determini la specimenaran grandecon. Antaŭaj metabolomikaj studoj celantaj malkovron de biosignoj15,18 estis konsiderataj kiel komparnormoj por grandecdetermino, kaj kompare kun ĉi tiuj raportoj, nia specimenaro estis adekvata. Neniuj specimenoj estis ekskluditaj el la studkohorto. Serumaj specimenoj estis hazarde asignitaj al malkovra grupo (306 kazoj, 74.6%) kaj interna validiga grupo (104 kazoj, 25.4%) por necelitaj metabolomikaj studoj. Ni ankaŭ hazarde selektis 70 kazojn el ĉiu grupo el la malkovra aro por celitaj metabolomikaj studoj. La esploristoj estis blindigitaj pri grupasigno dum LC-MS-datuma kolekto kaj analizo. Statistikaj analizoj de metabolomikaj datumoj kaj ĉelaj eksperimentoj estas priskribitaj en la respektivaj sekcioj Rezultoj, Figuraj Legendoj kaj Metodoj. Kvantigo de ĉela triptofano, NADT kaj glikoliza agado estis farita tri fojojn sendepende kun identaj rezultoj.
Por pliaj informoj pri la studdezajno, vidu la Resumon de la Raporto pri Natura Portfolio asociita kun ĉi tiu artikolo.
La krudaj MS-datumoj de la ekstraktitaj ecoj kaj la normaligitaj MS-datumoj de la referenca serumo estas montritaj en Aldonaj Datumoj 1 kaj Aldonaj Datumoj 2, respektive. Pintaj komentoj por diferencigaj ecoj estas prezentitaj en Aldonaj Datumoj 3. La LUAD TCGA-datumbazo elŝuteblas de https://portal.gdc.cancer.gov/. La enigaj datumoj por desegni la grafeon estas provizitaj en la fontaj datumoj. Fontaj datumoj estas provizitaj por ĉi tiu artikolo.
Nacia Studgrupo pri Pulma Rastrumo, ktp. Redukti la mortecon pro pulma kancero per malaltdoza komputita tomografio. Norda Anglio. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR kaj Prophet, PC Pulmakancera ekzameno uzante malaltdozan helikforman komputilan tomografion: rezultoj de la Nacia Pulma Ekzamena Studo (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Redukti pulmakanceran mortecon per volumetra komputila tomografio en randomigita studo. Norda Anglio. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Afiŝtempo: 18-a de septembro 2023