Diferenca diagnozo de pulmaj nodoj identigitaj per komputita tomografio (CT) restas defio en klinika praktiko.Ĉi tie, ni karakterizas la tutmondan metabolomon de 480 serumaj specimenoj, inkluzive de sanaj kontroloj, benignaj pulmaj noduloj kaj stadio I-pulma adenokarcinomo.Adenokarcinomoj elmontras unikajn metabolomajn profilojn, dum benignaj nodoj kaj sanaj individuoj havas altan similecon en metabolomaj profiloj.En la eltrovaĵgrupo (n = 306), aro de 27 metabolitoj estis identigita por diferencigi inter benignaj kaj malignaj nodoj.La AUC de la diskriminanta modelo en la interna validumado (n = 104) kaj ekstera validumado (n = 111) grupoj estis 0.915 kaj 0.945, respektive.Vojanalizo rivelis pliigitajn glikolizajn metabolitojn asociitajn kun malkreskinta triptofano en pulma adenokarcinoma serumo kompare kun benignaj noduloj kaj sanaj kontroloj, kaj sugestis ke triptofanasimilado antaŭenigas glikolizon en pulmaj kanceraj ĉeloj.Nia studo elstarigas la valoron de serumaj metabolitaj biomarkoj en taksado de la risko de pulmaj noduloj detektitaj de CT.
Frua diagnozo estas kritika por plibonigi postvivoprocentojn por kanceruloj.Rezultoj de la usona National Lung Cancer Screening Trial (NLST) kaj la eŭropa NELSON Study montris, ke ekzamenado per malalt-doza komputita tomografio (LDCT) povas signife redukti la mortecon de pulma kancero en altriskaj grupoj1,2,3.Ekde la disvastigita uzo de LDCT por pulma kancero-kribrado, la efiko de hazardaj radiografiaj trovoj de sensimptomaj pulmaj noduloj daŭre pliiĝis 4 .Pulmonaj nodoj estas difinitaj kiel fokusaj opakaĵoj ĝis 3 cm en diametro 5 .Ni alfrontas malfacilaĵojn por taksi la verŝajnecon de maligneco kaj trakti la grandan nombron da pulmaj noduloj detektitaj hazarde sur LDCT.Limigoj de CT povas konduki al oftaj sekvaj ekzamenoj kaj malveraj pozitivaj rezultoj, kondukante al nenecesa interveno kaj trotraktado6.Tial necesas evoluigi fidindajn kaj utilajn biomarkojn por ĝuste identigi pulman kanceron en la fruaj stadioj kaj diferencigi la plej multajn benignajn nodojn ĉe komenca detekto 7 .
Ampleksa molekula analizo de sango (serumo, plasmo, periferiaj sango-mononukleaj ĉeloj), inkluzive de genomiko, proteomiko aŭ DNA-metiligo8,9,10, kaŭzis kreskantan intereson en la eltrovo de diagnozaj biosignoj por pulma kancero.Dume, metabolomikaj aliroj mezuras ĉelajn finproduktojn kiuj estas influitaj per endogenaj kaj eksogenaj agoj kaj estas tial aplikitaj por antaŭdiri malsankomencon kaj rezulton.Likva kromatografio-tanda mas-spektrometrio (LC-MS) estas vaste uzata metodo por metabolomikaj studoj pro sia alta sentemo kaj granda dinamika intervalo, kiu povas kovri metabolitojn per malsamaj fizikokemiaj trajtoj11,12,13.Kvankam tutmonda metaboloma analizo de plasmo/serumo estis utiligita por identigi biosignojn asociitajn kun pulma kancero-diagnozo14,15,16,17 kaj terapiefikeco,18 serumaj metabolitklasifikiloj por distingi inter benignaj kaj malignaj pulmnoduloj restas multe studitaj.- amasa esplorado.
Adenokarcinomo kaj skvamoĉela karcinomo estas la du ĉefaj subtipoj de ne-malgrandĉela pulma kancero (NSCLC).Diversaj CT-ekzamenaj testoj indikas, ke adenokarcinomo estas la plej ofta histologia tipo de pulma kancero1,19,20,21.En ĉi tiu studo, ni uzis ultra-efikecan likvan kromatografion-alt-rezolucian mas-spektrometrion (UPLC-HRMS) por fari metabolomikan analizon sur totalo de 695 serumaj specimenoj, inkluzive de sanaj kontroloj, benignaj pulmaj noduloj kaj CT-detektita ≤3 cm.Rastrumo por Stadio I pulma adenokarcinomo.Ni identigis panelon de serumaj metabolitoj, kiuj distingas pulman adenokarcinomon de benignaj noduloj kaj sanaj kontroloj.Voja riĉiga analizo rivelis ke nenormala triptofano kaj glukoza metabolo estas oftaj ŝanĝoj en pulma adenokarcinomo kompare kun benignaj nodoj kaj sanaj kontroloj.Fine, ni establis kaj validigis seruman metabolan klasigilon kun alta specifeco kaj sentemo por distingi inter malignaj kaj benignaj pulmaj noduloj detektitaj de LDCT, kiuj povas helpi en frua diferenciga diagnozo kaj riska taksado.
En la nuna studo, seksaj kaj aĝaj serumaj specimenoj estis retrospektive kolektitaj de 174 sanaj kontroloj, 292 pacientoj kun benignaj pulmaj noduloj, kaj 229 pacientoj kun stadio I pulma adenokarcinomo.Demografiaj trajtoj de la 695 subjektoj estas montritaj en Suplementa Tabelo 1.
Kiel montrite en Figuro 1a, entute 480 serumspecimenoj, inkluzive de 174 sana kontrolo (HC), 170 benignaj noduloj (BN), kaj 136 etapo I pulma adenokarcinoma (LA) specimenoj, estis kolektita en Sun Yat-sen University Cancer Center.Discovery-kohorto por necelata metaboloma profilado uzanta ultra-efikecan likvan kromatografion-alt-rezolucian mas-spektrometrion (UPLC-HRMS).Kiel montrite en Suplementa Figuro 1, diferencaj metabolitoj inter LA kaj HC, LA kaj BN estis identigitaj por establi klasifikmodelon kaj plu esplori diferencigan vojon.104 specimenoj kolektitaj de Sun Yat-sen University Cancer Center kaj 111 specimenoj kolektitaj de du aliaj hospitaloj estis submetitaj al interna kaj ekstera validumado, respektive.
Studa populacio en la eltrovaĵkohorto kiu spertis tutmondan seruman metabolomics analizon uzantan ultra-efikecan likvan kromatografion-alt-rezolucian mas-spektrometrion (UPLC-HRMS).b Parta malplej kvadrataj diskriminacia analizo (PLS-DA) de la totala metabolomo de 480 serumspecimenoj de la studa kohorto, inkluzive de sanaj kontroloj (HC, n = 174), benignaj noduloj (BN, n = 170), kaj stadio I pulma adenokarcinomo. (Los-Anĝeleso, n = 136).+ESI, pozitiva elektrospray joniga reĝimo, -ESI, negativa elektrospray joniga reĝimo.c–e Metabolitoj kun signife malsamaj abundoj en du antaŭfiksitaj grupoj (duvosta Wilcoxon subskribita rangotesto, falsa malkovrofteco alĝustigita p valoro, FDR <0.05) estas montritaj en ruĝa (falda ŝanĝo> 1.2) kaj blua (falda ŝanĝo < 0.83) .) montrita sur la vulkangrafiko.f Hierarkia grupiga varmomapo montranta signifajn diferencojn en la nombro da komentitaj metabolitoj inter LA kaj BN.Fontaj datumoj estas provizitaj en formo de fontaj datumoj dosieroj.
La totala serummetabolomo de 174 HC, 170 BN kaj 136 LA en la eltrovaĵgrupo estis analizita uzante UPLC-HRMS-analizon.Ni unue montras, ke specimenoj de kvalitkontrolo (QC) amasiĝas firme en la centro de modelo de nekontrolita ĉefa kompona analizo (PCA), konfirmante la stabilecon de la agado de la nuna studo (Kuldona Figuro 2).
Kiel montrite en la parta malplej kvadrat-diskriminacia analizo (PLS-DA) en Figuro 1 b, ni trovis, ke estis klaraj diferencoj inter LA kaj BN, LA kaj HC en pozitivaj (+ESI) kaj negativaj (−ESI) elektrospraj jonigaj reĝimoj. .izolita.Tamen, neniuj signifaj diferencoj estis trovitaj inter BN kaj HC en +ESI kaj -ESI-kondiĉoj.
Ni trovis 382 diferencigajn ecojn inter LA kaj HC, 231 diferencigajn ecojn inter LA kaj BN, kaj 95 diferencigajn ecojn inter BN kaj HC (Wilcoxon subskribita rangotesto, FDR <0.05 kaj multobla ŝanĝo> 1.2 aŭ <0.83) (Figuro .1c-e) )..Pintoj estis plue komentitaj (Suplementaj Datumoj 3) kontraŭ datumbazo (biblioteko mzCloud/HMDB/Chemspider) per valoro m/z, retentempo kaj fragmentiĝo-masa spektro-serĉo (detaloj priskribitaj en la sekcio de Metodoj) 22 .Fine, 33 kaj 38 komentitaj metabolitoj kun signifaj diferencoj en abundo estis identigitaj por LA kontraŭ BN (Figuro 1f kaj Suplementa Tabelo 2) kaj LA kontraŭ HC (Suplementa Figuro 3 kaj Suplementa Tabelo 2), respektive.Kontraste, nur 3 metabolitoj kun signifaj diferencoj en abundo estis identigitaj en BN kaj HC (Aldona Tablo 2), kongruaj kun la interkovro inter BN kaj HC en PLS-DA.Ĉi tiuj diferencaj metabolitoj kovras ampleksan gamon de biokemiaĵoj (Kuldona Figuro 4).Kunigitaj, ĉi tiuj rezultoj montras signifajn ŝanĝojn en la serummetabolomo, kiuj reflektas malignan transformon de frua faza pulma kancero kompare kun benignaj pulmnoduloj aŭ sanaj temoj.Dume, la simileco de la serummetabolomo de BN kaj HC indikas ke benignaj pulmnoduloj povas kunhavi multajn biologiajn karakterizaĵojn kun sanaj individuoj.Konsiderante ke genaj mutacioj de epiderma kreskfaktorreceptoro (EGFR) estas oftaj en pulma adenokarcinoma subtipo 23, ni serĉis determini la efikon de ŝoforaj mutacioj sur la serummetabolomo.Ni tiam analizis la ĝeneralan metaboloman profilon de 72 kazoj kun EGFR-statuso en la pulma adenokarcinoma grupo.Kurioze, ni trovis kompareblajn profilojn inter EGFR-mutaciantaj pacientoj (n = 41) kaj EGFR-sovaĝaj pacientoj (n = 31) en PCA-analizo (Suplementa Figuro 5a).Tamen, ni identigis 7 metabolitojn, kies abundo estis signife ŝanĝita en pacientoj kun EGFR-mutacio kompare kun pacientoj kun sovaĝa tipo EGFR (t-testo, p < 0.05 kaj faldŝanĝo> 1.2 aŭ < 0.83) (Suplementa Bildo 5b).La plimulto de ĉi tiuj metabolitoj (5 el 7) estas acilcarnitines, kiuj ludas gravan rolon en grasacidaj oksidaj vojoj.
Kiel ilustrite en la laborfluo montrita en Figuro 2 a, biomarkoj por nodula klasifiko estis akiritaj per malplej absolutaj ŝrumpataj operatoroj kaj elekto bazita sur 33 diferencaj metabolitoj identigitaj en LA (n = 136) kaj BN (n = 170).Plej bona kombinaĵo de variabloj (LASSO) - binara loĝistika regresa modelo.Dekobla krucvalidado estis uzita por testi la fidindecon de la modelo.Varia elekto kaj parametra reguligo estas alĝustigitaj per verŝajnec-maksimumiga puno kun parametro λ24.Tutmonda metabolomika analizo estis plue farita sendepende en la interna validumado (n = 104) kaj ekstera validumado (n = 111) grupoj por testi la klasifikan agadon de la diskriminacia modelo.Kiel rezulto, 27 metabolitoj en la malkovra aro estis identigitaj kiel la plej bona diskriminacia modelo kun la plej granda averaĝa AUC-valoro (Fig. 2b), inter kiuj 9 pliigis agadon kaj 18 malpliigis agadon en LA kompare kun BN (Fig. 2c).
Laborfluo por konstrui pulman nodoklasigilon, inkluzive de elektado de la plej bona panelo de serumaj metabolitoj en la malkovra aro uzante binaran loĝistikan regresan modelon per dekobla krucvalidado kaj taksado de prognoza agado en internaj kaj eksteraj validaj aroj.b Trans-validigadstatistikoj de LASSO-regresa modelo por metabola biosigno-selektado.La nombroj donitaj supre reprezentas la mezan nombron da biosignoj elektitaj ĉe antaŭfiksita λ.La ruĝa punktlinio reprezentas la mezan AUC-valoron ĉe la ekvivalenta lambda.Grizaj eraraj stangoj reprezentas la minimumajn kaj maksimumajn AUC-valorojn.La punktita linio indikas la plej bonan modelon kun la 27 elektitaj biosignoj.AUC, areo sub la ricevilo funkciiga karakterizaĵo (ROC) kurbo.c Faldŝanĝoj de 27 elektitaj metabolitoj en la LA-grupo kompare kun la BN-grupo en la malkovra grupo.Ruĝa kolumno - aktivigo.La blua kolumno estas malkresko.d-f Ricevilaj funkciaj karakterizaj (ROC) kurboj montrantaj la potencon de la diskriminacia modelo bazita sur 27 metabolitkombinaĵoj en la eltrovaĵo, internaj, kaj eksteraj validumaroj.Fontaj datumoj estas provizitaj en formo de fontaj datumoj dosieroj.
Antaŭdira modelo estis kreita surbaze de la pezbalancitaj regresaj koeficientoj de ĉi tiuj 27 metabolitoj (Aldona Tablo 3).ROC-analizo bazita sur ĉi tiuj 27-metabolitoj donis areon sub la kurba (AUC) valoro de 0.933, malkovra grupo-sentemo estis 0.868, kaj specifeco estis 0.859 (Fig. 2d).Dume, inter la 38 komentitaj diferencaj metabolitoj inter LA kaj HC, aro de 16 metabolitoj atingis AUC de 0.902 kun sentiveco de 0.801 kaj specifeco de 0.856 en diskriminacio de LA de HC (Suplementa Bildo 6a-c).AUC-valoroj bazitaj sur malsamaj faldŝanĝaj sojloj por diferencaj metabolitoj ankaŭ estis komparitaj.Ni trovis, ke la klasifika modelo rezultis plej bone en diskriminacio inter LA kaj BN (HC) kiam la faldŝanĝnivelo estis fiksita al 1.2 kontraŭ 1.5 aŭ 2.0 (Kuldona Figuro 7a,b).La klasifikmodelo, bazita sur 27 metabolitgrupoj, estis plue validigita en internaj kaj eksteraj kohortoj.La AUC estis 0.915 (sentemo 0.867, specifeco 0.811) por interna validigo kaj 0.945 (sentemo 0.810, specifeco 0.979) por ekstera validigo (Fig. 2e, f).Por taksi interlaboratorian efikecon, 40 specimenoj de la ekstera kohorto estis analizitaj en ekstera laboratorio kiel priskribite en la sekcio de Metodoj.La klasifika precizeco atingis AUC de 0.925 (Suplementa Bildo 8).Ĉar pulma skvama ĉela karcinomo (LUSC) estas la dua plej ofta subtipo de ne-malgrandĉela pulma kancero (NSCLC) post pulma adenokarcinomo (LUAD), ni ankaŭ testis la validigitan eblan utilecon de metabolaj profiloj.BN kaj 16 kazoj de LUSC.La AUC de diskriminacio inter LUSC kaj BN estis 0.776 (Suplementa Bildo 9), indikante pli malbonan kapablon kompare kun diskriminacio inter LUAD kaj BN.
Studoj montris, ke la grandeco de noduloj sur CT-bildoj estas pozitive korelaciita kun la verŝajneco de maligneco kaj restas grava determinanto de nodula traktado25,26,27.Analizo de datumoj de la granda kohorto de la ekzamena studo de NELSON montris, ke la risko de maligneco en subjektoj kun nodoj <5 mm estis eĉ simila al tiu en subjektoj sen nodoj 28 .Tial, la minimuma grandeco postulanta regulan CT-monitoradon estas 5 mm, kiel rekomendite de la Brita Toraka Societo (BTS), kaj 6 mm, kiel rekomendite de la Fleischner Society 29 .Tamen, nodoj pli grandaj ol 6 mm kaj sen evidentaj benignaj trajtoj, nomataj nedeterminitaj pulmaj noduloj (IPN), restas grava defio en taksado kaj administrado en klinika praktiko30,31.Ni poste ekzamenis ĉu nodograndeco influis metabolomajn signaturojn uzante kunigitajn specimenojn de la malkovraj kaj internaj validumaj kohortoj.Koncentrante sur 27 validigitaj biomarkiloj, ni unue komparis la PCA-profilojn de HC kaj BN sub-6 mm metabolomoj.Ni trovis, ke la plej multaj el la datumaj punktoj por HC kaj BN interkovris, pruvante, ke serumaj metabolitaj niveloj estis similaj en ambaŭ grupoj (Fig. 3a).La trajtomapoj tra malsamaj grandecaj gamoj restis konservitaj en BN kaj LA (Fig. 3b, c), dum apartigo estis observita inter malignaj kaj benignaj nodoj en la 6-20 mm gamo (Fig. 3d).Ĉi tiu kohorto havis AUC de 0.927, specifecon de 0.868, kaj sentivecon de 0.820 por antaŭdiri la malignecon de noduloj mezurantaj 6 ĝis 20 mm (Fig. 3e, f).Niaj rezultoj montras, ke la klasigilo povas kapti metabolajn ŝanĝojn kaŭzitajn de frua maligna transformo, sendepende de nodograndeco.
ad Komparo de PCA-profiloj inter specifitaj grupoj surbaze de metabola klasigilo de 27 metabolitoj.CC kaj BN < 6 mm.b BN < 6 mm kontraŭ BN 6–20 mm.en LA 6–20 mm kontraŭ LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm kaj LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Ricevilo-funkciiga karakteriza (ROC) kurbo montranta diskriminacian modelefikecon por nodoj 6–20 mm.f Probablaj valoroj estis kalkulitaj surbaze de la loĝistika regresa modelo por nodoj mezurantaj 6-20 mm.La griza punktlinio reprezentas la optimuman tranĉvaloron (0.455).La supraj nombroj reprezentas la procenton de kazoj projekciitaj por Los-Anĝeleso.Uzu duvostan t-teston de Studento.PCA, ĉefkomponenta analizo.AUC-areo sub la kurbo.Fontaj datumoj estas provizitaj en formo de fontaj datumoj dosieroj.
Kvar specimenoj (aĝaj 44-61 jaroj) kun similaj pulmaj nodulaj grandecoj (7-9 mm) estis plue elektitaj por ilustri la agadon de la proponita modelo de prognozo de maligneco (Fig. 4a, b).Dum komenca rastrumo, Kazo 1 prezentita kiel solida nodo kun kalkiĝo, trajto asociita kun benigno, dum Kazo 2 prezentita kiel nedeterminita parte solida nodo kun neniuj evidentaj benignaj trajtoj.Tri rondoj de sekvaj CT-skanadoj montris, ke ĉi tiuj kazoj restis stabilaj dum 4-jara periodo kaj tial estis konsiderataj benignaj noduloj (Fig. 4a).Kompare kun klinika taksado de seriaj CT-skanadoj, analizo de unu-pafa seruma metabolito kun la nuna klasigilo-modelo rapide kaj ĝuste identigis ĉi tiujn benignajn nodojn bazitajn sur probablaj limoj (Tablo 1).Figuro 4b en kazo 3 montras nodolon kun signoj de pleŭra retiro, kiu plej ofte estas asociita kun maligneco32.Kazo 4 prezentita kiel nedeterminita parte solida nodo sen signoj de benigna kaŭzo.Ĉiuj ĉi tiuj kazoj estis antaŭdiritaj kiel malignaj laŭ la klasigilo-modelo (Tablo 1).La takso de pulma adenokarcinomo estis pruvita per histopatologia ekzameno post pulma resekcia kirurgio (Fig. 4b).Por la ekstera validiga aro, la metabola klasigilo precize antaŭdiris du kazojn de nedeterminitaj pulmaj noduloj pli grandaj ol 6 mm (Suplementa Bildo 10).
CT-bildoj de la aksa fenestro de la pulmoj de du kazoj de benignaj nodoj.En kazo 1, CT-skanado post 4 jaroj montris stabilan solidan nodulon je 7 mm kun kalkiĝo en dekstra malsupra lobo.En kazo 2, CT-skanado post 5 jaroj rivelis stabilan, parte solidan nodulon kun diametro de 7 mm en dekstra supra lobo.b Aksaj fenestro CT-bildoj de la pulmoj kaj ekvivalentaj patologiaj studoj de du kazoj de stadio I adenokarcinomo antaŭ pulma resekcio.Kazo 3 rivelis nodulon kun diametro de 8 mm en dekstra supra lobo kun pleŭra retiro.Kazo 4 rivelis parte solidan grundvitran nodon je 9 mm en maldekstra supra lobo.Hematoksilino kaj eozino (H&E) makulado de resekcita pulma histo (skaldrinkejo = 50 μm) montrante la acinaran kreskopadronon de pulmadenokarcinomo.Sagoj indikas nodojn detektitajn sur CT-bildoj.H&E-bildoj estas reprezentaj bildoj de multoblaj (>3) mikroskopaj kampoj ekzamenitaj fare de la patologiisto.
Kunigitaj, niaj rezultoj pruvas la eblan valoron de serumaj metabolitaj biomarkoj en la diferenca diagnozo de pulmaj noduloj, kiuj povas prezenti defiojn kiam oni taksas CT-rastrumon.
Surbaze de validigita diferenciga metabolita panelo, ni serĉis identigi biologiajn korelaciojn de gravaj metabolaj ŝanĝoj.KEGG-voja pliriĉiga analizo de MetaboAnalyst identigis 6 komunajn signife ŝanĝitajn vojojn inter la du donitaj grupoj (LA kontraŭ HC kaj LA kontraŭ BN, ĝustigita p ≤ 0.001, efiko> 0.01).Ĉi tiuj ŝanĝoj estis karakterizitaj de perturboj en piruvata metabolo, triptofana metabolo, niacino kaj nikotinamida metabolo, glicolizo, la TCA-ciklo kaj purina metabolo (Fig. 5a).Ni tiam plue elfaris celitajn metabolomikon por kontroli gravajn ŝanĝojn uzante absolutan kvantigon.Persistemo de oftaj metabolitoj en ofte ŝanĝitaj padoj per triobla kvarpola mas-spektrometrio (QQQ) uzanta aŭtentajn metabolitnormojn.Demografiaj karakterizaĵoj de la metabolomics-studa cela specimeno estas inkluzivitaj en Suplementa Tabelo 4. Konsekvence kun niaj tutmondaj metabolomics-rezultoj, kvanta analizo konfirmis, ke hipoksantino kaj xanthine, piruvato kaj laktato pliiĝis en LA kompare kun BN kaj HC (Fig. 5b, c, p <0,05).Tamen, neniuj signifaj diferencoj en tiuj metabolitoj estis trovitaj inter BN kaj HC.
KEGG-pada riĉiga analizo de signife malsamaj metabolitoj en la LA-grupo kompare kun la BN kaj HC-grupoj.Duvosta Globaltest estis uzata, kaj p-valoroj estis ĝustigitaj per la metodo Holm-Bonferroni (ĝustigita p ≤ 0.001 kaj efikgrandeco> 0.01).b–d Violonintrigoj montrantaj hipoksantino, ksantino, laktato, piruvato, kaj triptofanniveloj en serumo HC, BN, kaj LA determinita per LC-MS/MS (n = 70 per grupo).Blankaj kaj nigraj punktlinioj indikas la medianon kaj kvartilon, respektive.e Violinintrigo montrante normaligitan Log2TPM (transskribaĵoj per miliono) mRNA-esprimon de SLC7A5 kaj QPRT en pulmadenokarcinomo (n = 513) kompare kun normala pulma histo (n = 59) en la LUAD-TCGA-datumserio.La blanka kesto reprezentas la interkvartilan gamon, la horizontala nigra linio en la centro reprezentas la medianon, kaj la vertikala nigra linio etendiĝanta de la kesto reprezentas la 95%-konfidan intervalon (CI).f Pearson-korelacia intrigo de SLC7A5 kaj GAPDH-esprimo en pulmadenokarcinomo (n = 513) kaj normala pulma histo (n = 59) en la TCGA-datumserio.La griza areo reprezentas la 95% CI.r, Pearson-korelacia koeficiento.g Normaligitaj ĉelaj triptofanniveloj en A549-ĉeloj transfektitaj kun nespecifa shRNA-kontrolo (NC) kaj shSLC7A5 (Sh1, Sh2) determinita de LC-MS/MS.Statistika analizo de kvin biologie sendependaj provaĵoj en ĉiu grupo estas prezentita.h Ĉelaj niveloj de NADt (totala NAD, inkluzive de NAD+ kaj NADH) en A549 ĉeloj (NC) kaj SLC7A5 knockdown A549 ĉeloj (Sh1, Sh2).Statistika analizo de tri biologie sendependaj provaĵoj en ĉiu grupo estas prezentita.i Glikoliza agado de A549-ĉeloj antaŭ kaj post SLC7A5-knockdown estis mezurita per eksterĉela acidiĝoprocento (ECAR) (n = 4 biologie sendependaj specimenoj per grupo).2-DG,2-deoksi-D-glukozo.La t-testo de Duvosta Studento estis uzita en (b–h).En (g–i), eraraj stangoj reprezentas la meznombre ± SD, ĉiu eksperimento estis farita trifoje sendepende kaj la rezultoj estis similaj.Fontaj datumoj estas provizitaj en formo de fontaj datumoj dosieroj.
Konsiderante la signifan efikon de ŝanĝita triptofanmetabolo en la grupo LA, ni ankaŭ taksis serumajn triptofanajn nivelojn en la HC, BN, kaj LA grupoj uzante QQQ.Ni trovis, ke seruma triptofano estis reduktita en LA kompare kun HC aŭ BN (p <0.001, Figuro 5d), kio kongruas kun antaŭaj trovoj, ke cirkulantaj triptofanaj niveloj estas pli malaltaj en pacientoj kun pulma kancero ol en sanaj kontroloj de la kontrolgrupo33,34. ,35.Alia studo uzanta PET/CT-spurilon 11C-metil-L-triptofanon trovis, ke la triptofana signala retentempo en pulma kancera histo estis signife pliigita kompare kun benignaj lezoj aŭ normala histo36.Ni hipotezas, ke la malkresko de triptofano en LA-serumo povas reflekti aktivan konsumadon de triptofano de pulmaj kanceraj ĉeloj.
Estas ankaŭ konata, ke la fina produkto de la kinurenina vojo de triptofan-katabolo estas NAD+37,38, kiu estas grava substrato por la reago de gliceraldehido-3-fosfato kun 1,3-bisfosfoglicerato en glikolizo39.Dum antaŭaj studoj temigis la rolon de triptofan-katabolo en imuna reguligo, ni serĉis pliklarigi la interagon inter triptofan-malreguligo kaj glikolizaj vojoj observitaj en la nuna studo.Solva transportilo familio 7 membro 5 (SLC7A5) povas esti triptofantransportilo43,44,45.Kinolina acida fosforibosiltransferazo (QPRT) estas enzimo situanta laŭflue de la kinureninpado kiu transformas kinolinatan acidon al NAMN46.Inspektado de la datumaro de LUAD TCGA malkaŝis, ke kaj SLC7A5 kaj QPRT estis signife suprenreguligitaj en tumora histo kompare kun normala histo (Fig. 5e).Ĉi tiu pliiĝo estis observita en stadioj I kaj II same kiel stadioj III kaj IV de pulma adenokarcinomo (Suplementa Figuro 11), indikante fruajn perturbojn en triptofanmetabolo asociita kun tumorigenesis.
Aldone, la LUAD-TCGA-datumaro montris pozitivan korelacion inter SLC7A5 kaj GAPDH-mRNA-esprimo en kancerpacientaj specimenoj (r = 0.45, p = 1.55E-26, Figuro 5f).Kontraste, neniu signifa korelacio estis trovita inter tiaj genaj subskriboj en normala pulma histo (r = 0.25, p = 0.06, Figuro 5f).Frapo de SLC7A5 (Suplementa Figuro 12) en A549-ĉeloj signife reduktis ĉelan triptofanon kaj NAD (H) nivelojn (Figuro 5g, h), rezultigante malfortigitan glikolitan agadon laŭ mezuro de eksterĉela acidiĝoprocento (ECAR) (Figuro 1).5i).Tiel, surbaze de metabolaj ŝanĝoj en serumo kaj en vitro-detekto, ni hipotezas ke triptofanmetabolo povas produkti NAD + tra la kinurenina vojo kaj ludi gravan rolon en antaŭenigado de glikolizo en pulma kancero.
Studoj montris, ke granda nombro da nedeterminitaj pulmaj noduloj detektitaj de LDCT povas konduki al la bezono de pliaj provoj kiel PET-CT, pulma biopsio kaj trotraktado pro falsa pozitiva diagnozo de maligneco.31 Kiel montrite en Figuro 6, nia studo identigis panelon de serumaj metabolitoj kun ebla diagnoza valoro, kiu povas plibonigi riskan tavoliĝon kaj postan administradon de pulmaj noduloj detektitaj de CT.
Pulmnoduloj estas analizitaj uzante malalt-dozan komputitan tomografion (LDCT) kun bildigaj trajtoj sugestiaj je benignaj aŭ malignaj kialoj.La necerta rezulto de nodoj povas konduki al oftaj sekvaj vizitoj, nenecesaj intervenoj kaj troa traktado.La inkludo de serumaj metabolaj klasifikiloj kun diagnoza valoro povas plibonigi riskan taksadon kaj postan administradon de pulmaj nodoj.PET-positrona emisio-tomografio.
Datenoj de la usona NLST-studo kaj la eŭropa NELSON-studo sugestas, ke ekzamenado de altriskaj grupoj per malalt-doza komputita tomografio (LDCT) povas redukti la mortecon de pulmokancero1,3.Tamen, riska takso kaj posta klinika administrado de grandaj nombroj da hazardaj pulmaj noduloj detektitaj de LDCT restas la plej malfacilaj.La ĉefa celo estas optimumigi la ĝustan klasifikon de ekzistantaj LDCT-bazitaj protokoloj per asimilado de fidindaj biosignoj.
Iuj molekulaj biosignoj, kiel sangaj metabolitoj, estis identigitaj komparante pulmokancero kun sanaj kontroloj15,17.En la nuna studo, ni koncentriĝis pri la apliko de seruma metabolomika analizo por distingi inter benignaj kaj malignaj pulmaj noduloj hazarde detektitaj de LDCT.Ni komparis la tutmondan seruman metabolomon de sana kontrolo (HC), benignaj pulmaj noduloj (BN), kaj etapo I pulmo-adenokarcinoma (LA) specimenoj uzante UPLC-HRMS-analizon.Ni trovis, ke HC kaj BN havis similajn metabolajn profilojn, dum LA montris signifajn ŝanĝojn kompare kun HC kaj BN.Ni identigis du arojn da serumaj metabolitoj, kiuj diferencas LA de HC kaj BN.
La nuna LDCT-bazita identigskemo por benignaj kaj malignaj nodoj estas plejparte bazita sur la grandeco, denseco, morfologio kaj kreskorapideco de nodoj dum tempo30.Antaŭaj studoj montris, ke la grandeco de nodoj estas proksime rilatita al la verŝajneco de pulma kancero.Eĉ en pacientoj kun alta risko, la risko de maligneco en nodoj <6 mm estas <1%.La risko de maligneco por nodoj mezurantaj 6 ĝis 20 mm varias de 8% ĝis 64%30.Tial, la Fleischner Society rekomendas tranĉodiametron de 6 mm por rutina CT-sekvo.29 Tamen, riska taksado kaj administrado de nedeterminitaj pulmaj noduloj (IPN) pli grandaj ol 6 mm ne estis adekvate faritaj 31 .Nuna administrado de denaska kormalsano estas kutime bazita sur atenta atendado kun ofta CT-monitorado.
Surbaze de la validigita metabolomo, ni pruvis unuafoje la interkovron de metabolomaj subskriboj inter sanaj individuoj kaj benignaj noduloj <6 mm.La biologia simileco kongruas kun antaŭaj CT-trovoj, ke la risko de maligneco por nodoj <6 mm estas tiel malalta kiel por subjektoj sen nodoj.30 Oni devas rimarki, ke niaj rezultoj ankaŭ pruvas, ke benignaj nodoj <6 mm kaj ≥6 mm havas altan. simileco en metabolomaj profiloj, sugestante ke la funkcia difino de benigna etiologio estas konsekvenca nekonsiderante nodograndeco.Tiel, modernaj diagnozaj serumaj metabolitpaneloj povas disponigi ununuran analizon kiel ekskluziva testo kiam nodoj estas komence detektitaj sur CT kaj eble reduktas serian monitoradon.Samtempe, la sama panelo de metabolaj biosignoj distingis malignajn nodulojn ≥6 mm en grandeco de benignaj nodoj kaj disponigis precizajn prognozojn por IPN-oj de simila grandeco kaj ambiguaj morfologiaj trajtoj en CT-bildoj.Ĉi tiu serummetabolo-klasifikilo funkciis bone antaŭdiri la malignecon de nodoj ≥6 mm kun AUC de 0.927.Kunigitaj, niaj rezultoj indikas, ke unikaj serumaj metabolomaj subskriboj povas specife reflekti fruajn tumor-induktitajn metabolajn ŝanĝojn kaj havi eblan valoron kiel riskaj prognoziloj, sendepende de nodograndeco.
Precipe, pulmadenokarcinomo (LUAD) kaj skvamoĉela karcinomo (LUSC) estas la ĉeftipoj de ne-malgrandĉela pulma kancero (NSCLC).Konsiderante ke LUSC estas forte rilata al tabakuzo47 kaj LUAD estas la plej ofta histologio de hazardaj pulmaj noduloj detektitaj sur CT-rastrumo48, nia klasigilo-modelo estis specife konstruita por stadio I adenokarcinomaj specimenoj.Wang kaj kolegoj ankaŭ koncentriĝis pri LUAD kaj identigis naŭ lipidajn subskribojn uzante lipidomikon por distingi komencan pulman kanceron de sanaj individuoj17.Ni testis la nunan klasigilon-modelon sur 16 kazoj de stadio I LUSC kaj 74 benignaj nodoj kaj observis malaltan LUSC-prognozprecizecon (AUC 0.776), sugestante, ke LUAD kaj LUSC povas havi siajn proprajn metabolomajn signaturojn.Efektive, LUAD kaj LUSC estas montritaj diferenci en etiologio, biologia origino kaj genetikaj aberacioj49.Tial, aliaj specoj de histologio devus esti inkluditaj en trejnadmodeloj por populacio-bazita detekto de pulma kancero en ekzamenaj programoj.
Ĉi tie, ni identigis la ses plej ofte ŝanĝitajn vojojn en pulma adenokarcinomo kompare kun sanaj kontroloj kaj benignaj nodoj.Ksantino kaj hipoksantino estas oftaj metabolitoj de la purina metabola vojo.Konsekvence kun niaj rezultoj, intermetoj asociitaj kun purina metabolo estis signife pliigita en la serumo aŭ histoj de pacientoj kun pulma adenokarcinomo kompare kun sanaj kontroloj aŭ pacientoj en la antaŭinvasiva stadio15,50.Plialtigitaj serumaj ksantinniveloj kaj hipoksantinniveloj povas reflekti la anabolismon postulatan de rapide multiĝantaj kanceraj ĉeloj.Malregulado de glukoza metabolo estas konata markostampo de kancera metabolo51.Ĉi tie, ni observis signifan pliiĝon en piruvato kaj laktato en la grupo LA kompare kun la grupo HC kaj BN, kio kongruas kun antaŭaj raportoj pri anomalioj de glikoliza vojo en la serumaj metabolomprofiloj de pacientoj kun ne-malgrandĉela pulmokancero (NSCLC) kaj sanaj kontroloj.la rezultoj estas konsekvencaj52,53.
Grave, ni observis inversan korelacion inter piruvato kaj triptofan metabolo en la serumo de pulmaj adenokarcinomoj.Serumaj triptofanniveloj estis reduktitaj en la grupo LA kompare kun la grupo HC aŭ BN.Interese, antaŭa grandskala studo uzanta eventualan kohorton trovis, ke malaltaj niveloj de cirkulanta triptofano estis asociitaj kun pliigita risko de pulma kancero 54 .Triptofano estas esenca aminoacido, kiun ni ricevas tute el manĝaĵo.Ni konkludas, ke seruma triptofanmalplenigo en pulma adenokarcinomo povas reflekti rapidan malplenigon de ĉi tiu metabolito.Estas konate ke la finprodukto de triptofankatabolo per la kinureninpado estas la fonto de nova NAD+-sintezo.Ĉar NAD+ estas produktita ĉefe tra la savpado, la graveco de NAD+ en triptofanmetabolo en sano kaj malsano restas determinita46.Nia analizo de la TCGA-datumbazo montris, ke la esprimo de la triptofan-transportilo-soluta transportilo 7A5 (SLC7A5) estis signife pliigita en pulma adenokarcinomo kompare kun normalaj kontroloj kaj estis pozitive korelaciita kun la esprimo de la glikoliza enzimo GAPDH.Antaŭaj studoj ĉefe koncentriĝis pri la rolo de triptofan-katabolo en subpremado de la kontraŭtumora imuna respondo40,41,42.Ĉi tie ni pruvas, ke inhibicio de konsumado de triptofano per frapado de SLC7A5 en pulmaj kanceraj ĉeloj rezultigas postan malkreskon de ĉelaj NAD-niveloj kaj samtempa malfortiĝo de glikoliza agado.En resumo, nia studo provizas biologian bazon por ŝanĝoj en serummetabolo asociita kun maligna transformo de pulma adenokarcinomo.
EGFR-mutacioj estas la plej oftaj ŝoformutacioj en pacientoj kun NSCLC.En nia studo, ni trovis, ke pacientoj kun EGFR-mutacio (n = 41) havis ĝeneralajn metabolomajn profilojn similajn al pacientoj kun sovaĝa tipo EGFR (n = 31), kvankam ni trovis malpliigitajn serumajn nivelojn de iuj EGFR-mutaciantaj pacientoj en acilcarnitine-pacientoj.La establita funkcio de acilcarnitines estas transporti acilgrupojn de la citoplasmo en la mitokondrian matricon, kondukante al la oksigenado de grasacidoj por produkti energion 55 .Konsekvence kun niaj trovoj, lastatempa studo ankaŭ identigis similajn metabolomprofilojn inter EGFR-mutaciulo kaj EGFR-sovaĝtipaj tumoroj analizante la tutmondan metabolomon de 102 pulmaj adenokarcinomaj histoprovaĵoj50.Interese, acilcarnitina enhavo ankaŭ estis trovita en la EGFR-mutaciulgrupo.Tial, ĉu ŝanĝoj en acilcarnitine-niveloj reflektas EGFR-induktitajn metabolajn ŝanĝojn kaj la subestaj molekulaj vojoj povas meriti plian studon.
Konklude, nia studo establas seruman metabolan klasigilon por la diferenca diagnozo de pulmaj noduloj kaj proponas laborfluon, kiu povas optimumigi riskan taksadon kaj faciligi klinikan administradon bazitan sur CT-skanado-screenado.
Ĉi tiu studo estis aprobita de la Etika Komitato de la Kancera Hospitalo de la Universitato de Sun Yat-sen, la Unua Filia Hospitalo de la Universitato de Sun Yat-sen kaj la Etika Komitato de la Kancera Hospitalo de la Universitato de Zhengzhou.En la malkovraj kaj internaj validumgrupoj, 174 serumoj de sanaj individuoj kaj 244 serumoj de benignaj noduloj estis kolektitaj de individuoj spertantaj ĉiujarajn medicinajn ekzamenojn ĉe la Sekcio de Kankro-Kontrolo kaj Preventado, Sun Yat-sen University Cancer Center, kaj 166 benignaj nodoj.serumo.Etapo I pulmaj adenokarcinomoj estis kolektitaj de Sun Yat-sen University Cancer Center.En la ekstera validuma kohorto, estis 48 kazoj de benignaj noduloj, 39 kazoj de stadio I pulma adenokarcinomo de la Unua Filiigita Hospitalo de Sun Yat-sen University, kaj 24 kazoj de stadio I pulma adenokarcinomo de Zhengzhou Kancera Hospitalo.Sun Yat-sen University Kancer Center ankaŭ kolektis 16 kazojn de stadio I skvama ĉela pulma kancero por testi la diagnozan kapablon de la establita metabola klasigilo (pacientaj trajtoj estas montritaj en Suplementa Tabelo 5).Provaĵoj de la malkovra kohorto kaj interna validuma kohorto estis kolektitaj inter januaro 2018 kaj majo 2020. Specimenoj por la ekstera validuma kohorto estis kolektitaj inter aŭgusto 2021 kaj oktobro 2022. Por minimumigi seksan biason, proksimume egalaj nombroj da viraj kaj inaj kazoj estis asignitaj al ĉiu. kohorto.Discovery Team kaj Interna Revizia Teamo.Partoprenanta sekso estis determinita surbaze de mem-raporto.Informita konsento estis akirita de ĉiuj partoprenantoj kaj neniu kompenso estis disponigita.Subjektoj kun benignaj noduloj estis tiuj kun stabila CT-skanpoentaro je 2 ĝis 5 jaroj en la momento de analizo, krom 1 kazo de la ekstera validuma specimeno, kiu estis kolektita antaŭoperacie kaj diagnozita per histopatologio.Kun la escepto de kronika bronkito.Pulmaj adenokarcinomaj kazoj estis kolektitaj antaŭ pulma resekcio kaj konfirmitaj per patologia diagnozo.Fastaj sangospecimenoj estis kolektitaj en serumaj apartigtuboj sen iuj antikoagulantoj.Sangaj specimenoj estis koagulitaj dum 1 horo ĉe ĉambra temperaturo kaj tiam centrifugitaj je 2851 × g dum 10 minutoj je 4 °C por kolekti seruman supernatanton.Serumaj alikvotoj estis frostigitaj je -80 °C ĝis eltiro de metabolito.La Departemento de Kankro-Preventado kaj Medicina Ekzameno de la Kancero-Centro de Universitato Sun Jatsen kolektis naĝejon da serumo de 100 sanaj donacantoj, inkluzive de egala nombro da viroj kaj virinoj en aĝo de 40 ĝis 55 jaroj.Egalaj volumoj de ĉiu donanta specimeno estis miksitaj, la rezulta naĝejo estis alikvotita kaj stokita je -80 °C.La serummiksaĵo estis utiligita kiel referencmaterialo por kvalitkontrolo kaj datumnormigo.
Referenca serumo kaj testaj specimenoj estis degelitaj kaj metabolitoj estis ĉerpitaj per kombinita eltira metodo (MTBE/metanolo/akvo) 56 .Mallonge, 50 μl da serumo estis miksitaj kun 225 μl da glacimalvarma metanolo kaj 750 μl da glacimalvarma metil tert-butiletero (MTBE).Movu la miksaĵon kaj kovu sur glacio dum 1 horo.La specimenoj tiam estis miksitaj kaj vortico miksita kun 188 μl da MS-grada akvo enhavanta internajn normojn (13C-laktato, 13C3-piruvato, 13C-metionino, kaj 13C6-izoleŭcino, aĉetita de Cambridge Isotope Laboratories).La miksaĵo tiam estis centrifugita je 15,000 × g dum 10 minutoj je 4 °C, kaj la pli malalta fazo estis translokigita en du tubojn (125 μL ĉiu) por LC-MS-analizo en pozitivaj kaj negativaj reĝimoj.Fine, la provaĵo estis vaporigita al sekeco en altrapida vakua koncentrilo.
La sekigitaj metabolitoj estis rekonstruitaj en 120 μl da 80% acetonitrilo, vortexitaj dum 5 minutoj, kaj centrifugitaj je 15,000 × g dum 10 minutoj je 4 °C.Supernatantes estis transdonitaj en sukcenajn vitrofiolojn kun mikroenigaĵoj por metabolomics studoj.Sencela metabolomic-analizo sur ultra-efikeca likva kromatografio-alt-rezolucia mas-spektrometrio (UPLC-HRMS) platformo.Metabolitoj estis apartigitaj uzante Dionex Ultimate 3000 UPLC-sistemon kaj ACQUITY BEH Amide-kolumnon (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Akvoj).En pozitiva jona reĝimo, la movaj fazoj estis 95% (A) kaj 50% acetonitrilo (B), ĉiu enhavante 10 mmol/L amoniacetaton kaj 0.1% formikacidon.En negativa reĝimo, movaj fazoj A kaj B enhavis 95% kaj 50% acetonitrilo, respektive, ambaŭ fazoj enhavis 10 mmol/L amoniacetaton, pH = 9. La gradienta programo estis jena: 0-0.5 min, 2% B;0,5-12 min, 2-50% B;12–14 min, 50–98% B;14-16 min, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16.1-20 min, 2% B. La kolumno estis konservita ĉe 40 °C kaj la specimeno je 10 °C en la aŭtospecimplilo.La flukvanto estis 0,3 ml/min, la injekta volumo estis 3 μl.Q-Exactive Orbitrap mas-spektrometro (Thermo Fisher Scientific) kun elektrospray-jonigo (ESI) fonto estis funkciigita en plena skana reĝimo kaj kunligita kun la ddMS2 monitora reĝimo por kolekti grandajn volumojn da datenoj.La MS-parametroj estis fiksitaj jene: ŝpruc-tensio +3.8 kV/- 3.2 kV, kapilara temperaturo 320 °C, ŝirmgaso 40 arb, helpgaso 10 arb, sonda hejtilo temperaturo 350 °C, skanada gamo 70–1050 m/ h, rezolucio.70 000. Datenoj estis akiritaj uzante Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Por taksi datumkvaliton, kunigitaj kvalitkontrolo (QC) specimenoj estis generitaj forigante 10 μL alikvotoj de la supernatant de ĉiu specimeno.Ses kvalitkontrolaj specimenaj injektoj estis analizitaj komence de la analiza sekvenco por taksi la stabilecon de la UPLC-MS-sistemo.Kvalitkontrolaj specimenoj tiam estas periode enkondukitaj en la aron.Ĉiuj 11 aroj da serumaj specimenoj en ĉi tiu studo estis analizitaj de LC-MS.Alikvotoj de seruma naĝejmiksaĵo de 100 sanaj organdonacantoj estis utiligitaj kiel referencmaterialo en respektivaj aroj por monitori la ekstraktan procezon kaj alĝustigi por bat-al-lokaj efikoj.Sencela metabolomics analizo de la eltrovaĵkohorto, interna validumadkohorto, kaj ekstera validumadkohorto estis farita ĉe la Metabolomics Centro de Sun Yat-sen University.La ekstera laboratorio de Gŭangdonga Universitato de Teknologia Analiza kaj Testa Centro ankaŭ analizis 40 specimenojn de la ekstera kohorto por testi la agadon de la klasigilo-modelo.
Post eltiro kaj rekonstruo, absoluta kvantado de serumaj metabolitoj estis mezurita per ultra-alta rendimento likva kromatografio-tandema mas-spektrometrio (Agilent 6495 triobla kvarpolo) kun elektrospray joniga (ESI) fonto en multobla reakcia monitorado (MRM) reĝimo.Kolumno ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Akvoj) estis uzata por apartigi metabolitojn.La movebla fazo konsistis el 90% (A) kaj 5% acetonitrilo (B) kun 10 mmol/L amoniacetato kaj 0.1% amonia solvo.La gradienta programo estis kiel sekvas: 0-1.5 min, 0% B;1,5-6,5 min, 0-15% B;6,5-8 min, 15% B;8–8,5 min, 15%–0% B;8,5–11,5 min, 0% B.La kolumno estis konservita je 40 °C kaj la provaĵo je 10 °C en la aŭtospecimplilo.La flukvanto estis 0.3 mL/min kaj la injekta volumo estis 1 μL.MS-parametroj estis fiksitaj jene: kapilara tensio ± 3,5 kV, nebulizilo premo 35 psi, ingo-gasfluo 12 L/min, ingogasotemperaturo 350 °C, sekiga gastemperaturo 250 °C, kaj sekiga gasfluo 14 l/min.La MRM-konvertoj de triptofano, piruvato, laktato, hipoksantino kaj ksantino estis 205.0-187.9, 87.0-43.4, 89.0-43.3, 135.0-92.3 kaj 151.0-107.9 respektive.Datumoj estis kolektitaj uzante Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Por serumprovaĵoj, triptofano, piruvato, laktato, hipoksantino kaj ksantino estis kvantigitaj uzante alĝustigkurbojn de normaj miksaĵsolvoj.Por ĉelprovaĵoj, triptofanenhavo estis normaligita al la interna normo kaj ĉela proteinmaso.
Pinta eltiro (m/z kaj retentempo (RT)) estis farita uzante Compound Discovery 3.1 kaj TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Por forigi eblajn diferencojn inter aroj, ĉiu karakteriza pinto de la testprovaĵo estis dividita per la karakteriza pinto de la referenca materialo de la sama aro por akiri la relativan abundon.La relativaj normaj devioj de internaj normoj antaŭ kaj post normigo estas montritaj en Suplementa Tabelo 6. Diferencoj inter la du grupoj estis karakterizitaj per falsa malkovra indico (FDR<0.05, Wilcoxon subskribita rangotesto) kaj faldŝanĝo (>1.2 aŭ <0.83).Krudaj MS-datumoj de la ĉerpitaj trajtoj kaj referencaj serum-korektitaj MS-datumoj estas montritaj en Suplementaj Datumoj 1 kaj Suplementaj Datumoj 2, respektive.Pinta komentario estis farita surbaze de kvar difinitaj niveloj de identigo, inkluzive de identigitaj metabolitoj, supoze komentitaj kunmetaĵoj, supoze karakterizitaj kunmetitaj klasoj kaj nekonataj kunmetaĵoj 22 .Surbaze de datumbazaj serĉoj en Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), biologiaj kunmetaĵoj kun MS/MS kongruaj validigitaj normoj aŭ ĝustaj kongruaj komentarioj en mzCloud (poentaro> 85) aŭ Chemspider estis finfine elektitaj kiel intermediatoj inter la diferenciga metabolomo.Pintaj komentarioj por ĉiu trajto estas inkluzivitaj en Suplementaj Datumoj 3. MetaboAnalyst 5.0 estis uzata por univaria analizo de sum-normaligita metabolita abundo.MetaboAnalyst 5.0 ankaŭ taksis KEGG-padan riĉigan analizon bazitan sur signife malsamaj metabolitoj.Ĉefkomponentanalizo (PCA) kaj parta malplej kvadrataj diskriminacia analizo (PLS-DA) estis analizitaj uzante la ropls-programaran pakon (v.1.26.4) kun staknormaligo kaj aŭtoskalado.La optimuma modelo de biomarkilo de metabolito por antaŭdiri nodulan malignecon estis generita uzante binaran loĝistikan regreson kun malplej absoluta ŝrumpado kaj elekta funkciigisto (LASSO, R-pakaĵo v.4.1-3).La agado de la diskriminacia modelo en la detekto kaj validumado estis karakterizita per taksado de AUC bazita sur ROC-analizo laŭ la pROC-pakaĵo (v.1.18.0.).La optimuma probabla tranĉo estis akirita surbaze de la maksimuma Youden-indekso de la modelo (sentemo + specifeco - 1).Provaĵoj kun valoroj malpli aŭ pli grandaj ol la sojlo estos antaŭviditaj kiel benignaj noduloj kaj pulma adenokarcinomo, respektive.
A549-ĉeloj (#CCL-185, American Type Culture Collection) estis kreskigitaj en F-12K-medio enhavanta 10% FBS.Mallongaj harpinglaj RNA (shRNA) sekvencoj celantaj SLC7A5 kaj necelan kontrolon (NC) estis enigitaj en la lentiviran vektoron pLKO.1-puro.La kontraŭsensaj sekvencoj de shSLC7A5 estas kiel sekvas: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).Antikorpoj al SLC7A5 (numero 5347) kaj tubulino (numero 2148) estis aĉetitaj de Cell Signaling Technology.Antikorpoj al SLC7A5 kaj tubulino estis uzitaj ĉe diluo de 1:1000 por Western blot-analizo.
La Seahorse XF Glycolytic Stress Test mezuras eksterĉelan acidiĝon (ECAR) nivelojn.En la analizo, glukozo, oligomicino A, kaj 2-DG estis administritaj sinsekve por testi ĉelan glikolizan kapaciton kiel mezurite de ECAR.
A549-ĉeloj transfektitaj per ne-cela kontrolo (NC) kaj shSLC7A5 (Sh1, Sh2) estis tegitaj dum la nokto en 10 cm-diametraj pladoj.Ĉelmetabolitoj estis ĉerpitaj per 1 ml da glacie malvarma 80% akva metanolo.Ĉeloj en la metanolsolvo estis forskrapitaj, kolektitaj en novan tubon, kaj centrifugitaj je 15,000 × g dum 15 minutoj je 4 °C.Kolektu 800 µl da supernatante kaj sekigi per altrapida vakua koncentrilo.La sekigitaj metabolitbuletoj tiam estis analizitaj por triptofanniveloj uzante LC-MS/MS kiel priskribite supre.Ĉelaj NAD(H) niveloj en A549-ĉeloj (NC kaj shSLC7A5) estis mezuritaj uzante kvantan NAD+/NADH-kolorometrian ilaron (#K337, BioVision) laŭ la instrukcioj de la produktanto.Proteinniveloj estis mezuritaj por ĉiu specimeno por normaligi la kvanton de metabolitoj.
Neniuj statistikaj metodoj estis uzataj por determini la specimenan grandecon.Antaŭaj metabolomikaj studoj celitaj al biosigno-malkovro15,18 estis konsiderataj kiel komparnormoj por grandeca determino, kaj kompare kun ĉi tiuj raportoj, nia specimeno estis adekvata.Neniuj specimenoj estis ekskluditaj de la studa kohorto.Serumprovaĵoj estis hazarde asignitaj al eltrovaĵgrupo (306 kazoj, 74.6%) kaj interna validumadgrupo (104 kazoj, 25.4%) por necelaj metabolomics studoj.Ni ankaŭ hazarde elektis 70 kazojn de ĉiu grupo el la eltrovaĵo por celitaj metabolomikaj studoj.La enketistoj estis blindigitaj al grupa tasko dum LC-MS datumkolektado kaj analizo.Statistikaj analizoj de metabolomics datumoj kaj ĉelaj eksperimentoj estas priskribitaj en la respektivaj Rezultoj, Figura Legendoj, kaj Metodoj sekcioj.Kvantigo de ĉela triptofano, NADT, kaj glikoliza agado estis farita trifoje sendepende kun identaj rezultoj.
Por pliaj informoj pri la studa dezajno, vidu la Resumon pri Natura Portfolio-Raporto asociita kun ĉi tiu artikolo.
La krudaj MS-datumoj de la ĉerpitaj trajtoj kaj la normaligitaj MS-datumoj de la referenca serumo estas montritaj en Suplementaj Datumoj 1 kaj Suplementaj Datumoj 2, respektive.Pintaj komentarioj por diferencaj trajtoj estas prezentitaj en Suplementaj Datumoj 3. La datumaro de LUAD TCGA povas esti elŝutita de https://portal.gdc.cancer.gov/.La enirdatumoj por bildigi la grafeon estas disponigitaj en la fontodatenoj.Fontaj datumoj estas provizitaj por ĉi tiu artikolo.
National Lung Screening Study Group, ktp. Reduktante pulmokancero-mortecon per malalt-doza komputila tomografio.Norda Anglio.J. Med.365, 395-409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR kaj Prophet, PC Pulmo-kancero-ekzamenado uzante malalt-dozan helikforman CT: rezultoj de la National Lung Screening Study (NLST).J. Med.Ekrano 18, 109-111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Reduktante pulmokancera morteco kun volumetra CT-rastrumo en hazarda provo.Norda Anglio.J. Med.382, 503–513 (2020).
Afiŝtempo: Sep-18-2023