CRISPR) estas triageneracia genoma redakta tekniko: CRISPR revoluciigis la mondon

Agregataj regule interspacitaj mallongaj palindromaj ripetoj (CRISPR) estas triageneracia genoma redakta tekniko, kiu revoluciigis la mondon per siaj alt-trairaj rezultoj. Ĝi estis uzata por trakti diversajn biologiajn malsanojn kaj infektojn. Diversaj bakterioj kaj aliaj prokariotoj (kiel ekzemple arkeoj) ankaŭ havas CRISPR/Cas9-sistemojn por defendi kontraŭ fagoj. Estis raportite, ke CRISPR/Cas9-bazitaj strategioj povas inhibicii la kreskon kaj progreson de triobla negativa mama kancero (TNBC) celante eble ŝanĝitajn rezistancgenojn, transskribon kaj epigenetikan reguligon. Ĉi tiuj terapiaj intervenoj povas helpi trakti malfacilajn problemojn kiel ekzemple medikamentorezisto observita eĉ en TNBC. Nuntempe, diversaj metodoj estas uzataj por liveri CRISPR/Cas9 al celĉeloj, kiel ekzemple fizikaj (mikroinjekto, elektroporado kaj hidrodinamikaj reĝimoj), virusaj (adeno-asociitaj virusoj kaj lentivirusoj) kaj ne-virusaj (liposomoj kaj lipidaj nanopartikloj). )-partikloj). Kvankam diversaj modeloj estis evoluigitaj por studi la molekulajn kaŭzojn de TNBC (tuberkula ne-tuberkula kancero), la manko de sentemaj kaj celitaj metodoj por liveri genarajn redaktajn ilojn en vivo limigas ilian klinikan aplikon. Resumante, ĉi tiu recenzo amplekse ekzamenas la progreson, defiojn, limigojn kaj perspektivojn de CRISPR/Cas9-traktado por TNBC surbaze de ekzistanta evidenteco. Ni ankaŭ elstarigas kiel la kombinaĵo de artefarita inteligenteco kaj maŝinlernado povas plibonigi CRISPR/Cas9-strategiojn en la traktado de TNBC.
Kancero karakteriziĝas per nekontrolita ĉeldividiĝo, interrompo de ĉelciklaj kontrolpunktoj, kaj mutacioj en tumorsubpremantaj genoj (TSG-oj) (Matthews et al., 2022). Inter la malsamaj specoj de kancero, mama kancero estas la plej ofta tipo de kancero ĉe virinoj kaj havas altan mortoprocentaĵon tutmonde (Waks kaj Winer, 2019). Mama kancero estas heterogena malsano kun diversaj karakterizaĵoj, kiel histologiaj kaj biologiaj trajtoj, klinika prezento kaj konduto, kaj respondo al traktado (Weigelt et al., 2010). La klasifiko de mama kancero provizas precizajn komprenojn por diagnozo de mama kancero kaj tumorprognozo. La uzo de komunaj biosignoj kaj klinikopatologiaj trajtoj estis la ĉefa kriterio por la klasifiko de mama kancero (Tsang kaj Tse, 2019). La prognozo kaj respondo al traktado de mama kancero estas influitaj de multaj faktoroj, inkluzive de la ĉeesto de estrogena receptoro (ER), progesterona receptoro (PR), homa epiderma kreskofaktora receptoro 2 (HER2/neu), kaj histologia grado, tumortipo kaj grado. grandeco kaj limfganglia metastazo (Al-Tubaiti, 2020). Kvin internaj molekulaj subtipoj de mama kancero estis identigitaj, inkluzive de luminala A, luminala B, HER2-riĉigita, baz-simila kaj klaŭdin-malalta (Prat et al., 2015). TNBC estas molekula subtipo de kancero, kiu ne esprimas ĉiujn ER, PR kaj HER2 (Yin et al., 2020). Ĉi tiuj patologiaj trajtoj estas asociitaj kun TNBC, konfirmante ĝian rapidan progreson kaj pli agreseman naturon ol iu ajn alia tipo de mama kancero (Feng et al., 2018). Plie, Peru et al (2000) uzis mikroara teknologion por reklasifiki maman kanceron kaj identigi kvin internajn subtipojn de mama kancero (Cadenas, 2012). Baz-simila mama kancero estas subtipo de mama kancero, kiu havas trioble negativan fenotipon kaj estas asociita kun rapida progreso. Notindas, ke ĉiuj bazal-similaj mamaj kanceroj estas ofte misdiagnozitaj kiel TNBC (tuberkulaj kanceroj kun meza kancero), sed nur 77% estas TNBC; Kontraste, 71–91% de TNBC estas bazal-similaj, indikante, ke ĉi tiuj du specoj de mama kancero interkovriĝas kaj reprezentas malsamajn klasifikojn (Wang D.-Y. et al., 2019). Ĉi tio kreas bezonon karakterizi la diversecon de TNBC por klarigi prognozon kaj identigi eblajn respondojn al nunaj kaj estontaj traktadoj. Plie, TNBC respondecas pri 15–20% de ĉiuj kazoj de mama kancero kaj estas pli ofta ĉe virinoj sub 50 jaroj. Mutacioj de BRCA1 aŭ BRCA2 estis raportitaj en proksimume 20% de TNBC-kazoj (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020). Studoj ankaŭ montris, ke TNBC havas apartan imunan mikromedion, kiu inkluzivas altajn nivelojn de vaskulaj endotelaj kreskofaktoroj, tumor-asociitaj makrofagoj (TAMoj), tumor-infiltrantaj limfocitoj (TILoj), kaj aliaj molekuloj implikitaj en tumorkresko kaj migrado. Tial, kompreni la mikromedion de TNBC estas kritika por ĝia prognozo kaj kuracado (Fan kaj He, 2022).
Por taksi la prognozon de TNBC kaj certigi efikan kuracadon, gravas preciza diagnozo, ĉefe bazita sur imunohistokemio (IHC) por detekti ER, PR kaj HER2, kaj mamografio por detekti mamajn neoplasmojn. Tamen, mamografio ne povas adekvate prezenti intratumorajn trajtojn kiel nekrozon kaj fibrozon (Deepak Singh et al., 2021). Ĉar malbona prognozo kaj diagnozo malhelpas kuracistojn preskribi la ĝustajn medikamentojn (Chaudhary, 2020), diversaj strategioj estas uzataj por plibonigi la zorgadon de pacientoj kun TNBC. Nuntempe, du medikamentoj, doksorubicino kaj ciklofosfamido, estas uzataj ĉe pacientoj kun TNBC kaj montris bonajn rezultojn. Krome, aliaj platenaj medikamentoj estas uzataj, kiel karboplatino kaj cisplatino (Sikov et al., 2015). Krome, PARP-inhibiciiloj kiel Olaparib, Velaparib kaj PF-01367338 estis uzataj kiel eblaj kemioterapiaj medikamentoj por la kuracado de TNBC (Ishino et al., 2018). Ĉar oni raportis, ke la signalaj vojoj Wnt/b-Catenin, NOTCH, kaj Hedgehog estas implikitaj en la apero kaj progresado de TNBC (tuberkula ne-malgranda kancero), celi medikamentojn al ĉi tiuj vojoj povus esti grava strategio (Aysola et al., 2013). Kvankam kirurgio, radioterapio kaj kemioterapio restas la ĉefa traktado por TNBC hodiaŭ, signifa progreso estis farita en la disvolviĝo de novaj traktadoj, inkluzive de celita terapio, imunoterapio, diversaj CRISPR-rilataj genredaktadaj iloj kiel Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, ĉefa redaktado, kaj CRISPR/Cas9-celita genterapio. Ĉi tie ni fokusos pri diversaj CRISPR-rilataj genredaktadaj iloj uzataj en la traktado de TNBC. Inter ili, CRISPR/Cas9 ricevis vastan atenton.
Cas9n, ankaŭ konata kiel Cas9-nikzazo, estas genetike modifita variaĵo de la Cas9-proteino derivita de la CRISPR/Cas9-genoma redakta sistemo (Gupta et al., 2019). En sia originala formo, la Cas9-proteino enhavas du nukleazajn domajnojn: RuvC kaj HNH, kies ĉefa funkcio estas la fendado de ambaŭ DNA-fadenoj. Tamen, en Cas9n, unu el la nukleazaj domajnoj, HNH, estas genetike mutaciita kaj fariĝas neaktiva. Tial, la HNH-domajno de Cas9n restas nefunkcia. Nur la RuvC-domajno restas aktiva, permesante al Cas9n tranĉi aŭ krei rompojn sur unuopaj DNA-fadenoj (Trevino kaj Zhang, 2014). Kompare kun Cas9, Cas9n povas efike redukti ekstercelajn efikojn kaj precize plibonigi ĉelajn riparajn mekanismojn. Cas9n povas esti uzata por solvi diversajn problemojn, kiel ekzemple kreado de rompoj ĉe specifaj lokoj en duobla-fadena DNA. Por ĉi tiu celo, du Cas9n-molekuloj estis kombinitaj kaj uzitaj kune (Yee, 2016). Miksita stirpa kinazo 3 (MLK3) estas mitogen-aktivigita proteina kinazo, kiu funkcias kiel ŝlosila regulilo dum TNBC-metastazo (Cronan et al., 2012).
MLK3 povas aktivigi plurajn signalajn vojojn, kiuj kondukas al metastazo de triĉelaj ĉeloj (TNBC). Ekzemple, la c-Jun N-fina kinaza (JNK) vojo reguligas ĉelan motilecon kaj degeneron de la eksterĉela matrico, kaj MLK3 aktivigas la JNK-vojon, tiel pliigante ĉelan motilecon kaj donante invadajn ecojn (Rattanasinchai kaj Gallo, 2016). MLK3 ankaŭ reguligas EMT. Por fari tion, ĝi aktivigas transfluajn transkripcifaktorojn kiel Snail, Slug kaj Twist. Ĉi tiuj faktoroj inhibas la esprimon de epiteliaj markiloj kaj antaŭenigas la esprimon de mezenkimaj markiloj, kondukante al la akiro de metastaza fenotipo (Casalino et al., 2023). Oni observis, ke MLK3 ludas rolon en eksterĉela matrica matrico-remodelado kaj aktivigo de proteazoj kiel matriksaj metaloproteinazoj (MMP-oj), kiuj degradas la eksterĉelan matricon. Ĉi tio faciligas invadon kaj disvastiĝon de tumorĉeloj al malproksimaj lokoj (Katari et al., 2019). Tiel, antaŭaj studoj montris, ke MLK3 ludas kritikan rolon en TNBC. Rattanasinchai kaj Gallo uzis TNBC-modelojn por studi la rolon de MLK3 kaj trovis, ke ĝi antaŭenigas kanceran disvolviĝon per specifaj signalaj vojoj. Ili uzis CRISPR/Cas9n por redakti MLK3 kaj observis signifan redukton de TNBC-metastazo (Rattanasinchai kaj Gallo, 2016).
dCas9, ofte nomata neaktiva Cas9, estas modifita deriva formo de la proteino Cas9. Male al aktiva Cas9, al dCas9 mankas endonucleaza agado, kio malhelpas ĝin indukti duoble-fadenajn rompiĝojn de DNA. Tial, dCas9 povas esti uzata por precize celi specifajn regionojn de la genaro sen iuj ŝanĝoj aŭ modifoj al la DNA-sekvenco (Wang et al., 2016). En dCas9, du endonucleazaj proteinoj, RuvC kaj HNH, estas inaktivigitaj per subpremado de gravaj aminoacidaj restaĵoj. (Richter et al., 2016). Malgraŭ sia manko de DNA-disfenda agado, dCas9 ludas kelkajn gravajn rolojn en genetika esplorado kaj bioteknologio. Ekzemple, ĝi permesas bildigon de specifaj regionoj de la genaro, faciligas transskriban reguligon kaj antaŭenigas epigenezajn modifojn (Brocken et al., 2018).
La transkripcifaktoro ZEB1 (zinka fingro E-kesto liganta homeokesto 1) ludas specifan kaj kritikan rolon en mediado de epiteli-mezenkima transiro (EMT), ĉela procezo kiu okazas dum embria disvolviĝo, hista riparo kaj kancera progresado. Ĝi implikas la transformon de epiteliaj ĉeloj en mezenkimajn ĉelojn, rezultante en ŝanĝoj en ĉelmorfologio, motileco, invasiveco, ktp. (Wu et al., 2020). ZEB1 inhibas plurajn epiteliajn markilojn, kiel E-kaderino kaj Okludino, kiuj respondecas pri konservado de ĉel-ĉela adhero kaj poluseco de epiteliaj ĉeloj en TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Krome, ZEB1 aktivigas certajn markilojn kiel N-kaderino, vimentino kaj fibronektino (Konradi et al., 2014) kaj ankaŭ reguligas genojn implikitajn en citoskeleta remodelado kiel Rho GTPazoj kaj matriksaj metaloproteinazoj (MMPoj) (Huang et al., 2014). 2022), krome, ĝi ankaŭ influas diversajn signalajn vojojn kiel transformanta kreskofaktoro-β (TGF-β), Wnt-signalado, ktp., tiel antaŭenigante tumoran invadon kaj metastazon en TNBC (Chen et al., 2016). Multnombraj studoj kaj sciencaj pruvoj indikas, ke ZEB1 havas grandan potencialon kiel valora agento por la detekto kaj terapia interveno de TNBC. En lastatempa studo, Waryah et al. uzis TNBC-modelon kaj atingis kompletan subpremadon de ZEB1 per dCas9. Tiel, ili observis tre altan specifecon kaj preskaŭ kompletan inhibicion de ZEB1 en en vivaj kondiĉoj (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 estas genredakta ilo nomata CRISPR/Cpf1. Ĝi devenas de la sistemo CRISPR/Cas, kie la termino Cas12 rilatas al CRISPR-asociita proteino 12 (Bharathkumar et al., 2022), kiu estas tute simila al Cas9. La sola diferenco estas, ke ĝi enhavas la proteinon Cas12. Kompare kun Cas9, Cas12 havas kelkajn unikajn funkciojn, kiel ekzemple generado de gluecaj finaĵoj dum la genredaktada procezo, dum Cas9 generas malakrajn finaĵojn (Wang et al., 2021). Ĉi tiu eco de Cas12 kontribuas al ĝia specifa DNA-manipulada teknologio. Kiel proteino kapabla precize rekoni kaj tranĉi celan DNA-on, ĝi havas eksterordinaran versatilecon, igante ĝin efika ilo por diversaj aplikoj, inkluzive de genredaktado (Pickar-Oliver kaj Gersbach, 2019).
Simile al aliaj CRISPR-variaĵoj, CRISPR/Cas12 ankaŭ kapablas forigi aŭ aktivigi genojn en TNBC (tumorala ringocirkla kancero), celante genojn, kiuj ludas gravan rolon en ĝia patogenezo aŭ respondo al traktado (Yang kaj Zhang, 2023). Por plenumi ĉi tiun procezon, oni evoluigis gvidan RNA (gRNA), kiu direktas Cas12 al la cela geno. Post kiam Cas12 ligiĝas al sia celo, ĝi enkondukas duoble-fadenajn rompojn en DNA kaj aktivigas DNA-riparajn mekanismojn. Dum la riparprocezo, malĝustaj nukleotidoj povas esti integritaj, kondukante al genaj mutacioj kaj perdo de funkcio (Zhang et al., 2021a). Krome, plibonigita versio de la enzimo Cas12 (nomata dCas12) ankaŭ estis uzata por aktivigi genojn. Kombinante ĝin kun transskriba aktivigilo, eblas indukti certajn genojn, tiel aktivigante ilin. Ĉi tiu teknologio havas grandan potencialon por antaŭenigi la aktivigon de tumor-subpremantaj genoj (Sultan et al., 2022).
Prime-redaktado estas nove disvolvita kaj ekstreme supera genoma redakta teknologio. Ĝi kapablas modifi la DNA-on de organismo tre precize (Chen kaj Liu, 2023). Prime-redaktado estas atingita per la integrado de du ĉefaj komponantoj: modifita CRISPR/Cas9-enzimo kaj inversa transkriptazo. La rolo de la CRISPR/Cas9-enzimo estas selekteme celi precizajn lokojn en la genaro, dum inversa transkriptazo helpas plene modifi la DNA-on ĉe la cela loko (Hassan et al., 2021). En la enkonduka redakta mekanismo, la unua paŝo implikas la kreadon de enkonduka redakta gvida RNA (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Ĝi enhavas la celan sekvencon kaj RNA-ŝablonon respondantan al la dezirata redakta loko en la cela DNA. La pegRNA tiam estas enkondukita en celĉelojn kune kun enkonduka redakta nukleazo (PE2). PE2 estas fuzia proteino konsistanta el Cas9-enzimo, inversa transkriptazo kaj enkonduka redakta adaptilo (Martín-Alonso et al., 2021). Ene de la ĉelo, pegRNA kaj PE2-kompleksoj serĉas la specifan DNA-on, kiun ili volas modifi. La enzimo Cas9 tranĉas DNA-on kaj kreas ŝablonon konsistantan el unuopaj fadenoj (Choi et al., 2022). Inversa transkriptazo uzas ĉi tiun ŝablonon por prepari la DNA-on por redaktado. Kune kun kopiado de DNA, instrukcioj por redakti la RNA-ŝablonon ankaŭ estas inkluditaj. Fine, la nove kreita DNA-fadeno estas uzata kiel ŝablono por ripari la rompon en la DNA, rezultante en ŝanĝita DNA-sekvenco enhavanta la deziratan modifon (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Mekanismoj por redaktado de enkondukaj ingrediencoj povas konduki al ĝeneraligitaj mutacioj en genoj. Ĝi povas celi punktajn mutaciojn, enmetojn, forigojn, kaj eĉ genajn anstataŭigojn (Anzalone et al., 2019; Chen kaj Liu, 2023). Enkonduka redaktado ofertas plurajn avantaĝojn super antaŭaj genomaj redaktaj teknologioj. Ĉi tiuj inkluzivas pliigitan precizecon, reduktitajn ekstercelajn efikojn, kaj la kapablon redakti DNA-on sen dependi de duoblafadenaj DNA-rompoj (Anzalone et al., 2020).
La teknologio CRISPR/Cas9 estis origine evoluigita por protekti bakteriojn kontraŭ plasmida translokigo kaj faginfekto kaj poste estis reuzita kiel efika RNA-bazita DNA-cela ilo por genoma redaktado (Jiang kaj Doudna, 2017). Krome, la sistemo CRISPR/Cas9 laŭ raportoj ĉeestas en 50% kaj 87% de bakteriaj kaj arkeaj genaroj, respektive (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 estas potenciala ilo por forigo, enmeto kaj korekto de iu ajn nenormala genetika sekvenco uzante en vivajn kaj en vitrajn reĝimojn (Sabit et al., 2021). Plie, CRISPR/Cas9 montriĝis esti parto de la adapta imunsistemo pro sia specifeco por celaj genoj de intereso (Chen kaj Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 konsistas el Cas9 kaj ununura gvida RNA (sgRNA). Cas9 estas endonukleazo komponita el pluraj proteinaj komponantoj. Krome, Cas9 havas unikajn strukturajn kaj konformajn ecojn (Pacesa et al., 2022) ĉar ĝi konsistas el du loboj: rekona (REC) kaj nukleazo (NUC). La REC-lobo estas plue dividita en tri regionojn: REC1, REC2, kaj pontaj helicoj (Cromwell et al., 2018). La NUC konsistas el tri loboj, nome RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH kaj la protospaca apuda motivo (PAM) interaga domajno (Fig. 1) (Song et al., 2016). sgRNA konsistas el du komponantoj, inkluzive de CRISPR RNA (crRNA) kaj transkodanta malgranda RNA (spura RNA) (Figuro 1). La sgRNA konektas la Cas9-proteinon al koneksinoj por formi aktivan komplekson, ankaŭ konatan kiel la efektora komplekso (Richter et al., 2012). crRNA estas 18-20 nukleotida bazparo, kiu ludas kritikan rolon en rekono de celaj DNA-sekvencoj. Krome, crRNA pariĝas kun la cela DNA, kaj tracrRNA agas kiel skafaldo por la Cas9-nukleazo por ligiĝi al la cela DNA (Manghwar et al., 2019). Aliflanke, la PAM-sekvenco havas 3 nukleotidojn, kio konfirmas, specifas kaj mediacias la ligadon de la efektora komplekso al DNA. La Cas9-proteinkompleksaj subunuoj RuvC kaj HNH havas katalizan agadon (Richter et al., 2012; Asmamaw kaj Zawdie, 2021). La HNH-nukleaza domajno de la Cas9-subunuo fendas la DNA-fadenon asociitan kun la crRNA. La RuvC-nukleaza domajno fendas aliajn DNA-fadenojn kaj generas duoble-fadenajn rompojn (DSB-ojn), post kio du malsamaj DNA-rompo-riparaj mekanismoj estas aktivigitaj (Jiang kaj Doudna, 2017) (Figuro 1).
Figuro 1. Superrigardo de CRISPR/Cas9 (A). Komponantoj de la sistemo CRISPR/Cas9: (i). La endonukleazo Cas9 respondecas pri la tranĉado de la cela DNA-sekvenco, (ii) ununura gvidilo (sg) RNA rezultanta el la fuzio de crRNA kaj tra-crRNA ĥimeroj. (du). Cas9 inkluzivas plurajn komponantojn kiel Rec I, Rec II, NUC-lobon (HNH kaj Ruv C estas subkomponantoj) kaj PAM-interagan domajnon (C) kun respondaj funkcioj. La proteina komplekso CRISPR/Cas9 disigas DNA-sekvencojn en ne-komplementajn kaj komplementajn formojn (D). CRISPR/Cas9 redaktas la genaron en tri etapoj: rekono, tranĉado kaj riparo. La desegnita sg-RNA gvidas Cas9 kaj rekonas la deziratan sekvencon per la komplementa komponanto crRNA. Cas9 rekonas la PAM-sekvencon ĉe 5′-NGG-3′ kaj fandas la DNA-on, formante DNA-RNA-hibridon kaj aktivigante la disigon. La HNH-domajno de Cas9 fendas la komplementan fadenon, kaj la RuvC-domajno fendas la ne-komplementan fadenon. CRISPR/Cas9 riparas dufadenan DNA-on rompante ĝin laŭ du manieroj: ne-homologa fina kunigo (NHEJ) kaj homologie-direktita riparo (HDR). NHEJ riparas duoble-fadenan DNA-on en la foresto de fremda homologa DNA per enzima procezo, erarema mekanismo kiu povas enmeti aŭ forigi hazardajn DNA-sekvencojn. HDR estas tre specifa kaj postulas homologajn DNA-ŝablonojn.
CRISPR/Cas9-mediaciitaj riparvojoj inkluzivas ne-homologan finkunigon (NHEJ) kaj homologie-direktitan riparmekanismon (HDR). NHEJ estas erarema vojo ĉar ĝi implikas enmeton aŭ forigon kaj ne postulas ian ajn ŝablonon dum la riparmekanismo. Ĝi uzas hazardajn nukleotidojn por generi normajn proteinojn (Abbasi et al., 2021). Ĉi tiu riparsistemo konsistas el kvar kompleksoj kiel la KU-komplekso, la kruc-komplementanta proteina komplekso tipo 4 (XRCC-4), la DNA-fina prilabora enzimo, kaj la proteina kinazo DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). La KU-kompleksa proteino havas du subunuojn, Ku 70 kaj Ku 80, kaj ludas gravan rolon en la NHEJ-mekanismo, ĉar la riparmekanismo estas iniciatita per la ligado de du subunuoj (Ku 70 kaj Ku 80) al la malakraj aŭ preskaŭ malakraj finoj de la cela DNA (Abbasi et al., 2021), servante kiel skafaldo por rekruti aliajn NHEJ-rilatajn faktorojn al la loko de la vundo (Yang et al., 2020). XRCC-4 kaj DNA-ligazo konsistas el 334 kaj 911 aminoacidoj, respektive, kaj la XRCC4-DNA-ligaza IV-komplekso stimulas la ligadon de DNA-finoj (Chatterjee et al., 2015). DNA-fina prilabora enzimo, ankaŭ konata kiel polinukleotida kinazo 3'-fosfato, estas DNA-fina prilabora enzimo. Ĝi povas forigi la 3'P-grupon en DNA kaj fosforiligi la 5'OH-grupon dum DSB-riparo. Ĝi ankaŭ implikas riparon de unu-fadenaj rompoj (SSB-oj) uzante la SSB-riparvojon (Chatterjee et al., 2015). Proteina kinazo DNA-PKcs estas DNA-dependa proteinkinazo, kiu konsistas el kataliza subunuo de la PIKK-oj (fosfatidilinozitol 3-kinaz-rilataj kinazoj) kaj ataksia telangiektazia mutaciita (ATM) familio, same kiel ATM kaj Rad3-rilataj ATR-oj, fadenrompoj (DSB-oj) kaj unu-fadenrompoj (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR estas pli preciza kaj taŭga riparmekanismo ĉar la informoj estas kopiitaj uzante la sendifektan formon de la homologa DNA-duplekso, kvankam ĝi postulas la ĉeeston de fratinaj kromatidoj. Ĉi tio okazas dum la S/G2-fazo de la mamula ĉelciklo. HDR okazas ĉefe en gistospecioj, sed NHEJ estas kritika en mamuloj (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). La kompleta riparmekanismo estas montrita en Figuro 1.
Ĉar TNBC estas kaŭzita de genetikaj kaj epigenetikaj anomalioj, korekto de malignaj genomaj/epigenomaj anomalioj uzante CRISPR/Cas9 povus esti akceptebla terapia aliro (Chen et al., 2019). Krome, iuj transkripcifaktoroj implikitaj en ĉel-specifa transkripcia reguligo povus montri unikajn karakterizaĵojn de kanceraj ĉeloj, sugestante, ke transkripcia reguligo povus esti bonega aliro por kancertraktado (Drost et al., 2017). Ekspluati ĉi tiujn molekulajn trajtojn de tumoroj, kiel genetikajn, epigenetikajn kaj transkripciajn difektojn, por medikament-disvolviĝo povus plibonigi klinikajn rezultojn kaj redukti ekzamenajn kostojn. CRISPR estas potenciala gen-redaktada ilo, kiu povas ne nur detekti kaj identigi kancer-kaŭzantajn genomajn celojn, sed ankaŭ povas esti uzata por redakti, subpremi kaj epigenetike modifi onkogenojn en homaj ĉeloj (Tabelo 1) (Ahmed et al., 2021). Pluraj CRISPR-ekzamenoj estis faritaj por serĉi genojn asociitajn kun tumor-subpremantoj, onkogenoj kaj medikamentrezisto. La uzo de CRISPR/Cas9 por redakti diversajn TNBC-onkogenojn estas montrita en Figuro 2.
Figuro 2. Genredaktado de diversaj TNBC-onkogenoj uzante CRISPR/Cas9, rezultante en reduktita tumorkresko kaj metastazo. Ĉi tiuj onkogenoj inkluzivas CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 kaj CXCR7, Crypto1, ROR1 kaj ST8SIA, kiuj estas implikitaj en la okazo kaj metastazo de TNBC.
Migrado, invado, kaj epiteli-mezenkima transiro (EMT) de kanceraj ĉeloj estas asociitaj kun ITGA9. Antaŭaj studoj montris, ke ITGA9 estas ŝlosila ludanto en la Notch-vojo kaj ludas interesan rolon en rabdomiosarkoma metastazo (Molist et al., 2020). Krome, ITGA9 estis trovita proksime asociita kun pacienta prognozo en pluraj tumortipoj, inkluzive de mama kancero (Wang Z. et al., 2019). Krome, bioinformadika analizo de ITGA9 montris, ke ĝia esprimo en TNBC estis signife pli alta ol en aliaj mamakanceraj subtipoj. Levitaj ITGA9-niveloj estas asociitaj kun tumora metastazo kaj refalo en TNBC-pacientoj. Malaktivigo de ITGA9 per CRISPR/Cas9 rezultigis kancerajn stamĉel-similajn ecojn (CSC), tumorangiogenezon, tumorkreskon kaj reduktitan metastazon per antaŭenigado de β-catenin-degenero en TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 estas membro de la TGF-β familio kaj estas kritika por frua embriogenezo, stamĉela bontenado kaj kancera metastazo (Ishii et al., 2021). Ankaŭ konata kiel Tdgf-1, ĝi estas onkogena GPI-ankrita signalproteino implikita en la reguligo de la formado de la primitiva strio, mezodermo kaj endodermo, same kiel la establado de maldekstra/dekstra malsimetrio en la disvolviĝo de korpaj organoj dum embriogenezo (Zhang et al., 2021b). Plie, Cripto-1 montriĝis implikita en epiteli-mezenkima transiro (EMT) kiel stamĉela markilo (Zhang et al., 2021b). EMT estas kritika ne nur por diversaj procezoj kiel embria disvolviĝo, fibrozo kaj vundkuraciĝo, sed ankaŭ por kancera invado kaj metastazo. Plie, Cripto-1 montriĝis interagi kun kvar Notch-receptoroj kaj plibonigi ilian post-tradukan maturiĝon (Brandstadter kaj Maillard, 2019). La Notch-signalvojo estas konata pro sia partopreno en la bontenado de homaj mamakanceraj ĉeloj. Studoj montris, ke CRISPR/Cas9-mediaciita knokaŭto de Crypto-1 subpremas kanceran kreskon kaj metastazon. Tial, Crypto-1 povus fariĝi grava terapia celo por TNBC (Castro et al., 2015).
La proteino XCL12 kaj ĝia kemokina receptoro CXC (CXCR4 kaj CXCR7) ludas diversajn rolojn en la proliferado, kresko, migrado kaj invado de kanceraj ĉeloj (Wu et al., 2015). Ĉi tiuj kemoreceptoroj estis asociitaj kun la disvolviĝo de TNBC (tuberkulaj kanceraj ĉeloj) per multaj signalaj vojoj en kaj in vivo kaj in vitro modeloj (Wu et al., 2015). Krome, aktivigo de CXCR4 kaj CXCR7 estas asociita kun pli granda malsaniĝemo al metastazo kaj malbona prognozo en TNBC (Karn et al., 2022). Tial, la forigo de CXCR4 kaj CXCR7 povus fariĝi efikaj drogcelgenoj por la traktado de mama kancero, inkluzive de TNBC. Studo de Yang et al. (2019) uzis CRISPR/Cas9 por kun-forigi la genojn CXCR4 kaj CXCR7 kaj trovis, ke la proliferado, kresko, migrado kaj invado de TNBC estis signife inhibiciitaj (Yang et al., 2019).
Pliigitaj niveloj de miR-3662, onkogeno por TNBC-oj, estis observitaj en mamkanceraj histoj (Yi et al., 2022). Malaktivigo de miR-3662 montriĝis inhibicii la kreskon kaj metastazon de mamkanceraj tumoroj kaj in vivo kaj in vitro (Agarwal kaj Gupta, 2021). HBP-1 estas potenca inhibiciilo de Wnt/-catenin-signalado kaj verŝajne respondecas pri miR-3662-mediaciita kresko de TNBC-ĉeloj. Lastatempe, Yi et al. trovis, ke la akso miR-3662-HBP1 reguligas la Wnt/-catenin-signaladon en TNBC-ĉeloj (Yi et al., 2022). Pro sia tumor-specifa esprimo, miR-3662 povus esti ebla terapia celo por TNBC. Tiel, CRISPR/Cas9-mediaciita malaktivigo de miR-3662 povus esti bonega aliro por disvolvi novajn medikamentojn por la traktado de TNBC.
UBR5 estas 300 kDa nukleofosfoproteino, kiu estis identigita kiel ŝlosila reguliganto de tumorigenezo, metastazo kaj imunreago en diversaj kanceroj (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). UBR5 estis raportita esti tre suprenreguligita en TNBC-specimenoj kaj stimulas ERα-funkcion per induktado de proliferado per sia ubikvitina ligaza aktiveco (Bolt et al., 2015). Studoj de tuta eksoma sekvencado de primaraj TNBC-specimenoj ankaŭ montris pliigitan esprimon de UBR5, sugestante ĝian rolon en la disvolviĝo de TNBC. Plie, CRISPR/Cas9-movita forigo de UBR5 montris signifan inhibicion de TNBC-metastazo kaj kresko en eksperimentaj musmodeloj. Krome, inkludo de UBR5 en sovaĝ-tipa musmodelo restarigis ĝian plenan funkciecon, dum ĉi tiu efiko ne estis observita en inaktivigitaj mutaciulaj trostreĉoj (Liao et al., 2017). Manko de UBR5 estas asociita kun pliigita apoptozo, nekrozo, kaj inhibicio de tumorkresko en TNBC pro malbona angiogenezo. Pro la perdo de UBR5, la disvastiĝo de la tumoro al malproksimaj organoj estas reduktita, kaj UBR5 induktas nenormalan EMT ĉefe per redukto de la esprimo de E-kaderino (Zhang kaj Weinberg, 2018). Lastatempe, UBR5 montriĝis esti tre grava faktoro en IFN-γ-induktita PDL1-transskribo en TNBC pro sia manko de E3-ubikvitina aktiveco. Analizo de RNA-transskribaĵo rivelis, ke UBR5 povas havi sistemajn efikojn sur genoj asociitaj kun la IFN-γ-vojo kaj antaŭenigi PDL1-transaktivigon per pliigo de aktivigaj niveloj de proteinkinaza RNA (PKR) kaj ĝiaj signaltransduktiloj kaj aktivigiloj. transskribo 1 (STAT1) kaj interferona reguliga faktoro 1 (IRF1). Tamen, CRISPR/Cas9-mediaciita kombinita ablacio de UBR5 kaj PD-L1-esprimo havas sinergian terapian efikon ol ambaŭ blokoj sole, kun profundaj efikoj sur la tumora mikromedio (Wu et al., 2022). Tial, CRISPR/Cas9 povus esti grava ilo por inhibicii UBR5-funkcion, tiel subpremante TNBC-metastazon kaj tumorkreskon.
ROR1 estas transmembrana proteino de tipo I, kiu esprimiĝas dum kancero kaj embria disvolviĝo kaj estis identigita kiel onkofeta proteino (Nicholas Borcherding, 2014). La invasiva konduto de diversaj homaj kanceroj estas asociita kun pliigo de ROR1. Promesplenaj rezultoj estis akiritaj de in vivo kaj in vitro studoj implikantaj terapiajn komponaĵojn celantajn ROR1 (Chien et al., 2016). Levitaj niveloj de ROR1 mRNA en biopsioj de mamoj ankaŭ estis asociitaj kun agresemaj bazal-similaj mamaj (BL) tumoroj kaj ilia migrado al aliaj partoj de la korpo. Krome, troesprimo de ROR1 estis identigita kiel prognoza markilo por la disvolviĝo de TNBC (Chien et al., 2016). Tamen, silentigi ROR1 uzante CRISPR/Cas9 por subpremi TNBC-kreskon kaj metastazon estus efika strategio.
La sialiga procezo implikas la aldonon de sialata acido al glikokonjugatoj, kio estas katalizita de sialiltransferazoj (ST). ST8SIA1 apartenas al la ST-familio kaj ludas gravan rolon en la patogenezo de diversaj malsanoj kiel limfocita leŭkemio kaj kolorekta kancero (Chang et al., 2018). Analizo de RNA-sekvenco montras, ke ST8SIA1 estas tre esprimita en mama histo de pacientoj kun TNBC kaj estas pozitive korelaciita kun mutacioj en la tumorsubprema geno p53, kiuj povas kontribui al la patogenezo de TNBC (Battula et al., 2017). Krome, ST8SIA1 partoprenas en la metastazo kaj ripetiĝo de TNBC, sugestante, ke ĝi ludas gravan rolon en la okazo kaj evoluo de TNBC. En in vitro modelo de TNBC, oni montris, ke la malaktivigo de ST8SIA1 fare de CRIPSR/Cas9 blokas kreskon kaj metastazon (Battula et al., 2017). Ĉi tio sugestas, ke CRISPR/Cas9 povus esti grava ilo por inhibicii la funkcion de la ST8SIA1 onkogeno en la traktado de TNBC.
NAT1 estas metabola enzimo, kiu katalizas la formadon de fazo II ksenobiotikaj kombinaĵoj kaj estas esprimita en preskaŭ ĉiuj homaj histoj. NAT1 povas uzi la kofaktoron folato por celi acetil-CoA (acetil-CoA) eĉ en la foresto de la aroma amina substrato (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Studoj montris, ke NAT1 reguligas la funkcion de matriksa metaloproteinazo 9 (MMP9) en mamakanceraj ĉelmodeloj kaj protektas kontraŭ reaktivaj oksigenaj specioj (ROS) dum glukoza malsato (Wang et al., 2018). Forigo de NAT1 montriĝis inhibicii la piruvatan dehidrogenazan komplekson, kondukante al mitokondria misfunkcio (Wang L. et al., 2019). Plie, diversaj aliaj raportoj montris, ke NAT1-inhibicio uzante malgrandajn molekulojn kaj siRNA-silentigon povas redukti la invadecon kaj proliferadon de mamakanceraj ĉeloj (Stepp et al., 2018). Lastatempe, CRISPR/Cas9 estis uzata por subpremi NAT1 en la mamakancera ĉellinio MDA-MB-231, influante ĉelan metabolon depende de ĝia esprimonivelo. Ĉi tiu studo ankaŭ montris, ke NAT-1 estas kritika por la progresado kaj metastazo de TNBC (Carlisle et al., 2020).
Kunordigita transskribo de onkogenoj estas reguligita per super-plibonigiloj, transskripcifaktoroj kaj kofaktoroj (Hnisz et al., 2015). Krome, grupo de ciklin-dependaj kinazoj (CDK-oj), kiel ekzemple CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, kaj CDK13, estas necesaj por transskripcia reguligo. Inter ili, CDK7 partoprenas en la fosforiligo de RNA-polimerazo II, kiu estas tre grava por la komenco kaj vastiĝo de onkogena transskribo en la patogenezo de TNBC. En pionira studo, forigo de CDK7 per CRISPR/Cas9 inhibis TNBC, indikante ke la patogenezo de TNBC estas CDK7-dependa (Wang Y. et al., 2015).
Studoj montris, ke mutacioj en MYC kaj RBP (RNA-liganta proteino) povas konduki al apoptozo, dum unuopaj genaj mutacioj en MYC aŭ RBP ne influas la kreskon de kanceraj ĉeloj (Einstein et al., 2021). Pli ol 1000 RBP-oj en la homa genaro estis ekzamenitaj uzante CRISPR/Cas9-bazitan bibliotekon. Inter ili, 57 RBP-oj estis trovitaj kritikaj por la kresko de kanceraj ĉeloj kun tre levitaj MYC-niveloj (Wheeler et al., 2020). Krome, YTHDF2 estas grava por subteni TNBC-ĉelan kreskon kaj reduktas la kvanton de metiligitaj transskribaĵoj dum altnivela transskribo kaj traduko en kanceraj ĉeloj kun pli alta MYC-esprimo. Plie, YTHDF2 ne estas esenca por kanceraj ĉeloj, kiuj estas malpli dependaj de levitaj MYC-niveloj por plilongigi la supervivon de TNBC-pacientoj (Einstein et al., 2021), sugestante, ke ĝi povus esti ebla terapia celo por medikamentoj, kiuj povas venki TNBC.
Zinkaj fingroproteinoj (ZNF-oj) konsistigas proksimume 1% de la tuta homa genaro. Studoj montris, ke ZNF povas reguligi ĉelmultobliĝon en diversaj kanceroj, kiel ekzemple hepata kancero, mama kancero kaj kolorekta kancero (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Bibliotekoj generitaj per CRISPR-knokaŭto estis uzitaj por ekzameni diversajn tumor-subpremantajn genojn (TSG-ojn) en mamakanceraj ĉeloj (Shalem et al., 2014). Ekde tiam, transkriptomika studo de CRISPR/Cas9 ZNF319-forigitaj mamakanceraj ĉeloj montris, ke ZNF319 estas tumor-subpremanta geno, kiu reduktas mamakanceran proliferadon kaj tial estas implikita en diversaj eblaj signalaj mekanismoj kaj aliaj biologiaj funkcioj (Wang L. et al., 2022).
Feroptozo estas tipo de programita ĉelmorto, kiu dependas de la ĉeesto de fero. Oni scias, ke la disvolviĝo de feroptozo estas influita de la ĉeesto de lipidaj peroksidoj. Krome, oni raportis, ke PKCβII montras fruan lipidan peroksidadon, kaj pliigita lipida peroksidado estas asociita kun feroptozo. Rastrumo de biblioteko de CRISPR/Cas9-mediaciitaj kinazaj inhibitoroj rivelis, ke PKCβII estas implikita en la procezo de lipida peroksidado, kiu estas kritika por feroptozo en MDA-MB-231-ĉeloj (Zhang et al., 2022). Tial, tio sugestas, ke la forigo de PKCβII fare de CRISPR/Cas9 povus esti ebla celo por tumorsubprema geno por la traktado de feroptoz-rilataj malsanoj (Zhang et al., 2022).
Oni kredas, ke medikamentorezisto respondecas pri proksimume 90% de mortoj ĉe kanceruloj kaj estas unu el la ĉefaj defioj en kancertraktado (Bukowski et al., 2020). La rezultoj indikas, ke sufiĉa nombro da genoj rilataj al medikamentoelfluo, DNA-riparo, apoptozo kaj diversaj ĉelaj signalvojoj estas asociitaj kun medikamentorezisto (Haider et al., 2020). Inter ili, pluraj genoj estis celitaj de CRISPR/Cas9-iloj kaj montris promesplenajn rezultojn en reduktado de medikamentorezisto kaj pliigo de la efikeco de kontraŭkanceraj traktadoj (Vaghari-Tabari et al., 2022). Krome, alt-trairaj CRISPR/Cas9-genknokaŭtaj rastrumbibliotekoj estis implikitaj en modifado de la funkcio de eblaj medikamentorezistaj genceloj (Shalem et al., 2015). Por identigi paklitaksel-rezistemajn genojn, RNA-sekvencado kunligita kun tutgenoma sgRNA-biblioteko-rastrumo estis uzata por identigi ok kandidatgenojn, inkluzive de histona deacetilazo 9 (HDAC9), kiuj estas asociitaj kun drogrezisto en pacientoj kun ripetiĝanta TNBC (B et al., 2020). En alia studo, pliigita esprimo de diserino/treonino kaj tirozina proteinkinazo (DSTYK) estis observita dum la postvivado de TNBC-pacientoj traktitaj per kontraŭkanceraj drogoj. Krome, CRISPR/Cas9-mediaciita malaktivigo de DSTYK signife plifortigis apoptozon de drogorezistemaj kanceraj ĉeloj in vitro (SUM102PT-ĉeloj kaj MDA-MB-468-ĉeloj) kaj in vivo TNBC-modelo (Ogbu et al., 2021).
Kvankam TNBC (TNBC) havas nenormalan aktivigon de la MAPK-pado, la klinika efiko de MEK-celitaj terapioj estas malbona. Rastrumo de la genomika biblioteko CRISPR/Cas9 rivelis, ke inhibicio de PSMG2 (proteoma asemblea ŝaperono 2) sensibiligas TNBC BT549 kaj MB468-ĉelojn al la MEK-inhibitoro AZD6244. CRISPR/Cas9-malsuprenreguligo de PSMG2 ŝanĝis normalan proteasoman funkcion, kondukante al aŭtofagi-mediaciita malmuntado de PDPK1, tiel plue plibonigante tumorĉelojn en TNBC-musmodeloj induktitaj de AZD6244 (MEK-inhibitoro) kaj MG132 (proteasoma inhibitoro). Tiel, proteasomaj kaj MAP-kinazaj (MEK) inhibitoroj povas esti administritaj sinergie por redukti tumorĉelan proliferadon (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 ankaŭ estis uzata por ekzameni perdon de gena funkcio kondukanta al rezisto al TNBC (TNBC-oj) (Shu et al., 2020). Ge et al. klarigis la mekanismon de drogrezisto de kanceraj ĉeloj traktitaj per JQ1, BET-bromodomajna inhibiciilo (BBDI), en TNBC. Uzante CRISPR/Cas9, ili trovis, ke forigo de la rb1-geno kaŭzis, ke TNBC fariĝis rezistema al la kontraŭkancera drogo JQ1. Tial, rb1-funkcio estas grava en la respondo al JQ1-drogoj en TNBC. Ili ankaŭ raportis, ke paklitakselo estas CDK4/6-kinaza/mikrotubula inhibiciilo, kaj ĝia kombinaĵo kun BBDI-oj kiel JQ1 povus provizi promesplenajn terapiajn respondojn al drogrezistemaj TNBC (Ge et al., 2020).
La transskriba pejzaĝo de longa nekodanta RNA (lncRNA) estas raportita kiel respondeca pri rezisto al neoadjuvanta terapio en TNBC. Ĉi tiu studo montras, ke kvin malsamaj MALAT1 lncRNA-transskribaĵoj estas tre esprimitaj en TNBC. Plie, CRISPR/Cas9-mediaciita forigo de MALAT1 pliigis la sentemon de TNBC BT-549-ĉeloj al paklitakselo kaj doksorubicino, sugestante eblan rolon por MALAT1-rezisto en TNBC (Shaath et al., 2021).
Mutacioj en BRCA1 (BRCA1m) estas heterogenaj kaj tial malfacile detekteblaj. Celado de PARP1 (poli(ADP-riboza) polimerazo), la sinteza mortiga partnero de BRCA1, povus pliigi la kemosensibilecon al kontraŭkanceraj drogoj kiel doksorubicino, gemcitabino kaj docetakselo al mBRCA1-mutaciantaj TNBC-ĉeloj, sugestante, ke PARP1 ankaŭ partoprenas en drogrezisto en TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Mutacioj en la tumorsubpremantaj genoj BRCA1 aŭ BRCA2 estas konataj pro pliigo de la probableco de evoluigo de mama kancero ĉe homoj. Traktado de ĉi tiuj pacientoj postulas la uzon de PARP-inhibiciiloj. Plie, estis pruvite, ke forigo de la nukleotida savfaktoro DNPH1 uzante CRISPR/Cas9 povas forigi la toksan nukleotidan 5-hidroksimetildeoksiuridinan (hmdU) monofosfaton, tiel plifortigante la respondon de BRCA-mankhavaj ĉeloj al sentemo al PARP-inhibiciiloj (Fugger et al., 2021). Tiel, CRISPR/Cas9 kaj PARP1-inhibiciiloj povus fariĝi grava kuracstrategio por TNBC.
La penetranta glikoproteina (P-gp) geno estas multmedikamenta rezista geno, kiu ĝenerale estas suprenreguligita en proksimume 41% de ĉiuj TNBC (Sun et al., 2020). P-gp-induktita medikamentelfluo estis identigita kiel ŝlosila reguliganto de medikamentelrezisto en mama kancero. P-gp-inhibiciiloj montris pliigitan sentemon al kontraŭkanceraj medikamentoj en mama kancero (Famta et al., 2021). Tiel, CRISPR/Cas9-mediaciita ablacio aŭ subpremado de P-gp kaj P-gp-inhibiciiloj povas esti tre gravaj metodoj por venki medikamentelreziston en TNBC.
ATP-liganta kaseda transportilo G2 (ABCG2) estas konata kaŭzi drogoreziston en TNBC (Palasuberniam et al., 2015), kvankam nuntempe ne ekzistas raportoj pri la rilato inter CRISPR/Cas9 kaj ABCG2-silentigo kaj tumorsubpremanta geno-inaktivigo. PTEN povas plifortigi ABCG2-aktivigon (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Tial, uzi CRISP/Ca9 por forigi ABCG2 kaj kombini ĝin kun ABCG2-inhibitoro povus esti taŭga traktado por venki drogoreziston en TNBC. Tabelo 2 mencias CRISPR/Cas9 celantan ĉiujn rezistajn genojn.
Tabelo 2. CRISPR/Cas9 celas diversajn TNBC-rezistgenojn por sensibiligi ĉelojn al kontraŭkanceraj medikamentoj.
CRISPR/Cas9-bibliotekoj estas eblaj iloj por ekzameni genajn mutaciojn asociitajn kun kancera patogenezo (Chan et al., 2022). Ĉi tiu ekzamena metodo implikas kvar paŝojn kiel (a) bibliotekan konstruadon, (b) lentivirusan transdukton, (c) fenotipan ekzamenadon, kaj (d) celgenan analizon. Kvankam TNBC havas nenormalan aktivigon de la MAPK-vojo, la klinika prognozo de MEK-celita terapio por TNBC-pacientoj portantaj mutaciojn en tumorsubpremantaj genoj kiel PTEN, RB1, kaj TP53 estas tre malbona.
Plie, gena knokaŭta rastrumo uzante CRISPR/Cas9 testis la plej potencan kaj selekteman molekulon, dehidrokatrolon, kiu abundas en gvatemalaj floroj kaj foliekstraktoj, por kompreni la efikon de dehidrokatrolo sur MDA-MB-231. Mekanismoj de selektema ĉela citotokseco. Mezenkimaj tigecaj karakterizaĵoj de TNBC-subtipoj. Ĉi tiu CRISPR/Cas9-bazita rastrumo ankaŭ rivelis, ke HSD17B11, geno kiu kodas 17β-hidroksisteroidan dehidrogenazon tipo 11, estas tre esprimita en MDA-MB-231-ĉeloj kaj rezultas en dehidrofalkarinolo specifa por MDA-MB-231-ĉeloj (Grant et. al., 2020). Tiel, ĉi tio sugestas, ke CRISPR/Cas9 genomika rastrumo havas grandan potencialon en identigado de la mekanismoj subestantaj la kontraŭkancerajn ecojn de eblaj naturaj kombinaĵoj.
Krome, la vundebleco de TNBC (tutgenomaj ĉelĉeloj) al kancero estis studita uzante senantaŭjuĝan tutgenoman en viva CRISPR/Cas9-rastrumon, kiu montris ligon inter onkogenaj kaj tumorsubpremaj vojoj. Ŝlosilaj komponantoj de la mTOR kaj Hippo-vojoj laŭ raportoj ludas gravajn rolojn en tumorreguligo en TNBC. Plie, studoj montris, ke farmakologia inhibicio de mTORC1/2 kaj YAP-onkoproteino efike inhibicias la patogenecon de TNBC uzante en vitran medikamento-matrican sinergian modelon kaj en vivajn pacient-derivitajn ksenograftaĵojn. Plie, Torin-1-mediaciita mTORC1/2-inhibicio plifortigas makropinocitozon, dum verteporfin-induktita YAP-inhibicio kondukas al TNBC-ĉelmorto. Sume, ĉi tiuj rezultoj elstarigas la potencon kaj fortikecon de tutgenoma en viva CRISPR-rastrumo por identigi novajn kaj efikajn traktadojn por TNBC (Dai et al., 2021).
Misregulado de la imunsistemo estas grava faktoro en tumorigenezo. Kanceraj ĉeloj evitas imunan forigon preterirante defendmekanismojn, inkluzive de interferado kun la agado de imunĉeloj en la tumora mikromedio kaj kompromiti la imunsistemon. Tial, evoluigi plibonigitan imunsistemon povus esti ŝlosila aliro al la batalo kontraŭ tumoroj. La uzo de CRISPR/Cas9-bazita genmodifo traktas plurajn problemojn rilatajn al imuna misfunkcio el malsamaj perspektivoj. CRISPR/Cas9 estis uzata por plibonigi kontraŭtumoran imunecon kontraŭ mama kancero per la jenaj vojoj (Figuro 3).
Figuro 3. CRISPR/Cas9 imunoterapio celas TNBC-ĉelojn. Perdo de CDK5 kaj malaktivigo de PDL1 kaj CD155 plifortigas la imunsistemon. Simile, perdo de A2AR kaj malaktivigo de TAA-oj kiel HER2, mucino 1 kaj TEM8 pliigis la efikecon de CAR-T-ĉeloj en mortigado de kanceraj ĉeloj. CRISPR/Cas9-movita T-ĉela rastrumo montris, ke interrompo de p38-kinazo plifortigas T-ĉelan kontraŭtumoran agadon. T-ĉeloj modifitaj per CRISPR/Cas9 pliigas la esprimon de TCR (T-ĉela receptoro), rezultante en T-ĉeloj havantaj kontraŭtumoran agadon.
La celo de imunoterapio estas stimuli la imunsistemon por ataki kancerajn ĉelojn. Troesprimo de imunaj kontrolpunktaj proteinoj kutime malhelpas aŭtoimunajn reagojn, sed povas helpi kancerojn eviti ilin (Topalian et al., 2015). Ĉi tiuj proteinoj malhelpas imunajn reagojn per ligado al receptoroj sur la surfaco de imunĉeloj. Multnombraj kontrolpunktaj proteinoj (kiel CD155 kaj PD-L1) celas la PD-1-receptoron sur imunĉeloj kaj estas esprimitaj en mama kancero, precipe TNBC (TNBC) (Li Y.-C. et al., 2020). Malaktivigo de PD-L1 aŭ ĝia receptoro uzante CRISPR/Cas9 povas stimuli la imunsistemon por ataki TNBC-tumorojn (Yahata et al., 2019). Plie, malsuprenreguligo de PD-L1-esprimo per CRISPR/Cas9-mediaciita forigo de CDK5 montriĝis inhibicii tumorkreskon in vitro kaj in vivo (Deng et al., 2020). Kreskinhibicio en in vitro kaj in vivo modeloj de mama kancero sugestas, ke shRNA-mediaciita redukto de CD155 povus havi terapian efikon sur mama kancero (Gao et al., 2018).
CAR-T-ĉeloj esprimas CAR-ojn, kiuj rekonas tumor-asociitajn antigenojn (TAA-ojn) kaj povas uzi malaktivigon de kontrolpunktaj proteinoj por plifortigi sian aktivecon (Li C. et al., 2020). Ekzistas diversaj eblaj celoj por CAR-T-ĉela terapio en mama kancero, inkluzive de pluraj TAA-oj kiel HER2, mucin1, kaj TEM8 (Bajgain et al., 2018). Ekzistas indicoj, ke CAR-T-ĉeloj celantaj mezotelinon (troesprimitan en TNBC BT-459-ĉeloj) estas pli efikaj kontraŭ kancero kiam PD-1 estas malaktivigita uzante CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Tamen, izoli T-ĉelojn de pacientoj kaj poste redakti ilin ekstervive estas laborintensa kaj tempopostula procezo. Kvankam universalaj T-ĉeloj povas redukti izoladajn postulojn, donacaj T-ĉeloj esprimantaj homan leŭkocitan antigenon (HLA) klason I kaj T-ĉelan receptoron (TCR) devus esti forigitaj por malhelpi transplantaĵon-kontraŭ-gastigan anomaliojn (Ren et al., 2017, 2017a). Uzante CRISPR/Cas9, HDR povas samtempe elimini TCR kaj HLA kaj forigi la genon kodantan CAR. Studoj montris, ke CRISPR/Cas9 povas esti uzata por enkonduki kontraŭ-CD19 CAR-ojn en la TCR-lokuson, tiel efike produktante CAR-ojn sen malplenigi T-ĉelojn (Dimitri et al., 2022). Multpleksaj teknologioj estis evoluigitaj por generi alogenajn CAR T-ĉelojn per samtempa eliminado de TCR, beta-2-mikroglobulino (B2M), HLA-I-subunuo kaj aliaj proteinoj kiel PD-1 kaj CTLA-4, kiuj eble havas pli grandajn kontraŭkancerajn ecojn kontraŭ TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Uzi CRISPR/Cas9 povus plibonigi la efikecon de CAR-T-ĉeloj. Adenozino estas konata pro sia imunosupresiva eco kaj povas redukti kontraŭkanceran imunecon per blokado de T-ĉela funkcio kaj aktivigo de adenozinaj A2A-receptoroj (A2AR) (Vigano et al., 2019). Silentigo de A2AR uzante CRISPR/Cas9 signife plibonigis la efikecon de CAR-T-ĉeloj in vivo (Giuffrida et al., 2021). T-ĉeloj estas konataj pro diversaj fenotipaj karakterizaĵoj kiel ĉela ekspansio, diferenciĝo, oksidativa streso kaj genomika streso. CRISPR/Cas9-bazita T-ĉela rastrumo rivelis interrompon de 25 malsamaj T-ĉelaj receptoraj kinazoj. Inter ili, forigo de p38-kinazo montriĝis plifortigi la kontraŭtumoran agadon de T-ĉeloj, indikante ke p38-kinazo estas ŝlosila reguliganto de CAR-T-ĉela reguligo (Gurusamy et al., 2020).
T-ĉeloj povas esti genetike modifitaj uzante CRISPR/Cas9 por produkti tre esprimitajn TCR-ojn. Transdono de genetike modifitaj T-ĉeloj al pacientoj montris pli fortan kontraŭkanceran agadon ol endogenaj T-ĉeloj. Tial, endogenaj TCR-oj povas konkuri kun genetike ŝanĝitaj TCR-oj en pacientoj, kio povas influi la potencialon de kancera imunoterapio. Por superi ĉi tiun problemon, uzante CRISPR/Cas9 por forigi endogenan TCR-β en ricevantaj ĉeloj kaj poste transdoni TCR-β T-ĉelojn al kanceruloj povas montri pli bonajn kontraŭkancerajn imunajn respondojn sen la bezono de endogena seksa konkurenco kun TCR (Fan et al. 2018). Tiel, kun la escepto de CRISPR-modifitaj T-ĉeloj, TCR-oj estas mil fojojn pli sentemaj al tumoraj antigenoj ol normalaj TCR-transduktitaj T-ĉeloj. Plie, en diversaj leŭkemioj, ŝanĝitaj T-ĉeloj generitaj de γδ TCR+ CRISPR montras pli altan esprimon de CD4+ kaj CD8+ T-ĉeloj ol norma TCR-transdono (Legut et al., 2018). Tiel, modifitaj T-ĉeloj generitaj per CRISPR/Cas9 povus esti efika imunoterapia metodo por venki TNBC.
Integrinoj estas ĉeladheriĝaj molekuloj, kiuj ĉeestas en ĉelaj transmembranoj kaj antaŭenigas la ligadon de ĉeloj al la eksterĉela matrico (ECM) (Hamidi kaj Ivaska, 2018). Misregulado de integrinoj estas asociita kun kancera disvolviĝo kaj migrado per ŝanĝo de la eksterĉela matrico, kondukante al supervivo de kanceraj ĉeloj en la cirkulado (Hamidi kaj Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9-mediaciita integrina malrapidigo malrapidigas tumoran progreson, metastazon kaj koloniigon en TNBC. Malaktivigo de integrino a5 (ITGA5) laŭ raportoj reduktas ĉelan migradon kaj progreson en aliaj kanceroj kiel pulma kancero (Ju et al., 2017), sugestante, ke integrino a5 ankaŭ povus esti ŝlosila faktoro en la patogenezo de TNBC.
Generado de knokaŭtaj musoj uzante tradiciajn metodojn de embriaj stamĉeloj (ES) estas laborintensa, tempopostula kaj malefika procezo. Daŭras monatojn kaj jarojn por celi ES-ĉelojn per homologa rekombinado, bredi ĥimerajn musojn, kaj poste krucigi ilin kun heterozygotaj musoj por produkti homozygotajn idojn. Kompleksa krucbredado estas necesa por krei musojn kun multoblaj genetikaj mutacioj. Tamen, multaj problemoj ekestis uzante musojn generitajn per ablacio de ES-ĉeloj uzante CRISPR/Cas9 aŭ per mikroinjektado de CRISPR/Cas9-komponantoj en unuĉelajn fekundigitajn ovojn. Ekzemple, enkonduko de ŝanĝoj ofte okazas ĉe bialelaj lokusoj kaj ne estas genspecifa. Ĵus estis raportite, ke ES-ĉeloj uzantaj CRISPR/Cas9-teknologion povas samtempe enmeti bialelajn mutaciojn en ĝis 5 genojn (Nishizono et al., 2021). Por ĉi tiu celo, Cas9 mRNA kaj kvin genspecifaj gRNA-oj estis samtempe transfektitaj en ES-ĉelojn. Ĉi tio elstarigas la promeson kaj efikecon de ĉi tiu proceduro, kvankam ĉi tiuj mutacioj eble estis transdonitaj kiam fondintaj linioj estis breditaj por produkti kvinoblajn knokaŭtajn musojn. La studo ankaŭ raportas surprizan malkovron: ES-ĉeloj jam ne estas bezonataj por krei genetike modifitajn musojn. Anstataŭe, por forigi specifajn genajn produktojn, Cas9 mRNA kaj gRNA estis injektitaj en unuĉelajn embriojn. Rezulte, knokaŭtaj fondintaj linioj estis kreitaj, kiuj teorie povas esti uzataj por studi la sekvojn de genforigo en musoj (Qin et al., 2016). Tiel, CRISPR/Cas9 permesas la kreadon de transgenaj musoj por trakti TNBC je pli malalta kosto ol tradicia gentekniko. Uzante la CRISPR/Cas-sistemon, nova knokaŭta musmodelo estis evoluigita, kiu povas sukcese enkonduki punktajn mutaciojn en unu aŭ pluraj endogenaj genoj en TNBC. Surbaze de ĉi tiu koncepto, bestaj modeloj de TNBC ankaŭ povas esti evoluigitaj uzante CRISPR/Cas9-mediaciitan forigon de BRCA1 kaj p53, rezultante en perdo de HR-riparo, genomika malstabileco kaj mutaciaj fenotipoj (Annunziato et al., 2020).
Nuntempe, diversaj metodoj kiel mamografio, magneta resonanca bildigo (MRB) kaj ultrasono estas uzataj por diagnozi TNBC-on. Tamen, ĉi tiuj metodoj havas kelkajn limigojn. Mamografio estas uzata por diagnozi lokan maman histon anstataŭ metastazojn, kie kanceraj ĉeloj migris al aliaj organoj. Ultrasonografio ne estas fidinda metodo por diagnozi TNBC-on (Chen kaj Lee-Felker, 2023). MR havas pli altan sentemon ol ultrasono kaj mamografio, sed ĝia diagnoza precizeco estas limigita (Sha kaj Chen, 2022). Hista biopsio estas invasiva maniero identigi kancerajn ĉelojn. Tamen, en iuj kazoj, biopsio povas maltrafi kanceran histon se la pinglo devias de la interesata areo. Krome, ĝi estas tre multekosta kaj povas esti traŭmata por la paciento. TNBC estas heterogena tipo de kancero, do biopsio eble ne provizas sufiĉe da informoj pri la tipo de kancero. Tial, nova diagnoze fidinda metodo por detekti TNBC-on estas urĝe bezonata. CRISPR/Cas9 povas servi kiel tre sentema kaj minimume invasiva alternativo por diagnozo de mama kancero. Por tiu celo, strategioj bazitaj sur CRISPR/Cas9 povas esti uzataj por plibonigi PCR-metodojn por la diagnozo de TNBC (tnbc). Unue, la proteinoj Cas9 kaj cpf1 de la CRISPR-sistemo estas uzataj por forigi nespecifan DNA-on, kaj poste ĉi tiuj du proteinoj (Cas9 kaj cpf1) povas rekoni la PAM-sekvencon antaŭ ol ligiĝi al la cela DNA (Deepak Singh et al., 2021). Tiel, PCR povas identigi mutaciojn asociitajn kun kancerevoluo. Pluraj studoj adoptis ĉi tiun CRISPR-bazitan strategion por detekti malsamajn mutaciojn en malsamaj kanceroj (Safari et al., 2019). Tiel, CRISPR-bazitaj PCR-metodoj povas redukti la dependecon de diagnozo de TNBC de enpenetraj metodoj kiel biopsi-bazita imunohistokemio.
Genotipaj ŝanĝoj en la reguligo de hormonaj receptoroj ankaŭ estis montritaj en TNBC (Chen kaj Russo, 2009). CRISPR/Cas9-bazitaj PCR-strategioj uzantaj mikromatricojn por diagnozoj ĉeloke povas efike monitori ĉi tiujn mutaciojn (Hajian et al., 2019). Ĝi ankaŭ povus provizi al sanprovizantoj gravajn informojn pri specifaj mutacioj en TNBC-pacientoj, kio povus helpi plibonigi ilian kuracadon. Tamen, ĉi tiu kombinita tekniko havas limigojn. Tial, ampleksaj esplorklopodoj estas necesaj antaŭ ol ĉi tiu CRISPR/Cas-PCR-metodo povas esti uzata en sanservo por la diagnozo de TNBC (Yang et al., 2019).